荧光定量实验方法操作手册

荧光定量仪操作指南1.准备工作在使用荧光定量仪之前，需要进行一些准备工作：-打开仪器电源，并接通仪器的电源线。

-启动仪器，并等待其自检完成。

-检查仪器所需的配件是否齐全，如荧光管、滤光片等。

2.校准仪器在进行荧光定量测量之前，需要对仪器进行校准，以确保测量结果的准确性。

校准通常包括两个步骤：-波长校准：使用标准荧光溶液，根据其发射波长设置仪器的激发和发射波长。

-亮度校准：使用标准荧光溶液，根据其知名的荧光强度设置仪器的亮度。

3.准备样品在测量样品之前，需要进行一些准备工作：-根据测定要求，选择合适的荧光染料，并将其溶解在适当的溶剂中。

-在样品舱中选择合适的载体，如荧光底板或石英反射板，并将样品涂覆在载体上。

4.进行测量在开始测量之前，需要进行一些操作：-打开样品舱盖，并将载体放置在样品舱中。

-选择适当的激发波长和发射波长，并将它们设置到仪器上。

-调节仪器上的曝光时间，以确保荧光强度在仪器的线性范围内。

5.数据分析测量完成后，需要对数据进行分析：-使用仪器上的软件导出数据，并存储到计算机中。

-对数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。

-通过比较样品间的荧光强度，得出相应的结论。

6.清洁和维护在使用荧光定量仪完成实验后，需要进行仪器的清洁和维护工作：-关闭仪器电源，并拔下电源线。

-将使用过的载体和滤光片取下，并进行清洗。

-清洁仪器的外壳和光学系统，可以使用干净的纸巾或专门的清洁剂。

注意事项：-避免直接接触荧光管，以免对其造成损坏。

-在测量荧光强度之前，应先调节仪器的对比度和亮度，以获得清晰的图像。

-在测量过程中，尽量避免光线干扰，可在实验室内提供充足的遮光条件。

总结：以上是荧光定量仪的操作指南。

正确操作荧光定量仪是确保实验结果准确的重要步骤，希望本文对您在实验中使用荧光定量仪时有所帮助。

荧光定量PCR实验操作流程1、实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。

二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

3）充分研磨直至无可见组织块。

4）12000rpm离心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

6）4℃下12000rpm离心10min。

7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11）4℃下12000rpm离心5min。

12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。

16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl 逆转录引物。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4）于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

荧光定量PCR检测MMP-2 mRNA的表达一、提取细胞总RNA(一)材料准备1.注意事项（1）RNA酶广泛存在于人体表面和环境中，戴口罩，勤换手套，避免皮肤与实验器具接触；专门的RNA操作区，保持清洁，定期消毒离心机，移液器均应专用。

（2）注意冰上操作，低温离心，实验所需试剂均应-4℃冰箱中预冷处理。

（3）所有实验器皿，材料都要经过去RNA酶处理，所需的氯仿、异丙醇、乙醇等都确保没有被RNA酶污染。

如果发现有污染，立即更换。

（4）操作人员保证操作的准确性，避免人为产生误差和偏倚。

2.实验器具处理：（1）塑料制品：包括枪头、EP管等，尽量使用一次性塑料制品。

若已表明为RNase-free 制品，且没有开封使用过，不需要再处理。

去除RNA酶处理步骤为：玻璃烧杯中加三蒸水和DEPC使其终浓度为0.1%（DEPC二乙基焦碳酸酷为剧毒物，通风橱中小心使用），将待处理的塑料制品逐个浸泡入DEPC水中，保证塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风橱中室温下处理过夜，取出后尽量控干其中液体，高压后烘干，置洁净处备用。

（2）玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净后0.1%DEPC-H20浸泡过夜，烤干备用。

(二)试剂配制1.DEPC水：吸取1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配制成0.1%DEPC水，充分搅拌混匀后分装，备用。

2.75%乙醇：用无水乙醇加DEPC水（高压灭菌处理后的DEPC水）按比例配制，-4℃冰箱保存备用。

3.异丙醇：DEPC水处理过的棕色瓶中保存。

4.氯仿：DEPC水处理过的棕色瓶中保存。

(三)实验操作步骤1.标本收集根据实验设计，给予不同浓度的药物作用于人卵巢癌SKOV3细胞24h，观察MMP-2 mRNA表达的变化。

按实验要求收集样本，分别提取细胞的总RNA。

2.Trizol法提取细胞总RNA（1）吸除6孔板中的旧培养基，使用PBS清洗2次。

（2）吸除PBS，每孔加入0.9ml RNA裂解液(Trizol)，轻轻平晃板身,使裂解液覆盖底面与细胞充分接触并完全裂解细胞。

荧光定量PCR实验指南荧光定量PCR（qPCR）是一种能够对DNA或RNA的特定序列进行定量分析的技术。

它结合了PCR技术和荧光检测技术，能够检测出非常低浓度的靶分子。

本文将为您提供一份荧光定量PCR实验的指南，以帮助您完成这一实验。

实验前的准备工作：1.设计引物和探针：引物和探针是荧光定量PCR实验的核心组成部分，因此需要确保它们与目标序列特异性结合。

同时，还需选择合适的荧光染料和探针的浓度。

2.准备实验材料：包括引物、探针、荧光染料、模板DNA或RNA、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等。

3.准备质量控制样品：根据需要制备相应的阳性对照样品，并准备阴性对照样品。

实验步骤：1.反应体系的准备：根据PCR试剂盒使用说明或自行优化，将引物、探针、荧光染料、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等加入PCR管（注意按顺序添加，避免污染）。

2.加入模板：将模板DNA或RNA加入PCR管中，注意保持反应体系的稳定。

3.PCR条件设定：根据目标序列的特性和PCR试剂盒的要求设定PCR反应的温度、时间和周期数。

4.PCR反应：将PCR管密封，然后置于热循环仪中进行PCR反应。

5.数据分析：使用荧光定量PCR软件分析PCR反应产生的荧光信号，得到目标序列的定量结果。

注意事项：1.严格控制实验室的污染，使用无核酸污染的试剂和器材，避免引物和探针的降解。

2.对于荧光定量PCR的标准曲线方法，可以使用标准品系列的不同浓度来制作标准曲线，并根据荧光信号的强度进行定量。

3.在实验过程中，建议进行阳性和阴性对照样品的实验，以确保实验结果的准确性。

4.合理选择PCR管的容量，适量调整反应体系的配比，以保证实验的稳定性和可重复性。

总结：荧光定量PCR是一种非常强大的技术，能够在基因表达调控、感染病原体检测、突变检测等多个领域发挥重要作用。

在进行荧光定量PCR实验时，我们需要设计特异性的引物和探针，并合理选择荧光染料和探针的浓度。

荧光定量PCR仪标准操作指导书1、适用范围：AGS AGS4800型实时荧光定量PCR仪。

1、双击桌面“AGS4800”快捷方式，运行程序。

打开AGS4800程序进入用户选择界面。

选择用户后，进入软件操作界面。

2、新建一个检测程序文件单击新建按钮，新建一个检测程序文件。

2.1设置热盖温度调节热盖温度(30-105℃)，默认105℃。

2.2设置试管加液量根据实际试管加液量调节加液量参数（5-100μl），默认25μl。

2.3设置扩增程序单击“添加”创建一个程序段2.4添加程序名称，设置各程序段循环数。

2.5温度设置功能按钮添加--------------------在当前温度节结尾，新建一个温度节插入--------------------在当前温度节前添加一个温度节删除--------------------将当前温度节删除2.6 样本信息录入2.6.1打开样本参数设置界面2.6.2在当前程序染料设置里，选择试剂所对应的染料。

2.6.３样本信息设置选择扩增的染料，选中要设置孔位依次输入“样本序号、样本名称、样本ID”，在荧光信息选择框中选择样本类型，若为标准品可以输入样本浓度信息。

样本浓度信息可以手工输入数值或者使用下拉选择框选取标准样品浓度信息。

最大样本浓度输入值1.00e+10。

2.6.4孔位选择单孔选择-----------------通过鼠标单击选中单个孔位。

相邻孔位选择--------------通过单击鼠标并拖动选择矩形框内相邻孔位或者先选中一个孔位，按住“Shift”功能键单击另一孔位进行选择。

不连续孔位选择---------通过按住“Ctrl”功能键进行依次追加选择孔位。

A（B）行全选----------在A（B）行开始位置单击鼠标则选中A(B)行所有孔位。

孔位全选-----------------在图示位置单击鼠标左键则全选所有孔位。

选择孔位增减-------------按住“Ctrl”键，使用鼠标单击需增加或减少的孔位。

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。

对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。

Archimed实时荧光定量PCR系统Archimed Analyzer（Software Version1.08）简明操作手册非洲猪瘟检测鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司利用Archimed荧光定量PCR仪完成一个非洲猪瘟检测实验共分8个步骤，如下图所示操作流程图：1.启动系统1.1启动电脑显示器、主机；1.2打开仪器后底板的电源开关，电源状态灯POW为蓝色，常亮；1.3等待系统自检，自检过程中状态灯STU为绿色闪烁状态，自检通过后为绿色常亮；1.4双击桌面软件图标，启动软件；1.5软件启动中界面；1.6软件启动完成后界面；2.创建实验2.1点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；2.2点击菜单栏的“从模板创建”，可以通过之前已保存的实验运行模板创建新实验。

3.设置实验属性点击页面左侧的实验属性选项，进入实验属性设置界面：3.1实验名称：系统默认以实验当前的时间而命名，也可以自己命名，但目前不支持中文和特殊字符，这里以系统默认名称命名；3.2仪器型号：根据实际使用机型进行选择，这里以选择Archimed-X6系统为例；3.3反应管类型：根据实际使用的反应管类型进行选择，这里以选择白管为例；3.4实验类型：选择绝对定量和相对定量（ΔΔCt）都可以，但是不能选择熔解曲线，我们这里选择绝对定量。

3.5实验试剂：根据实际使用的试剂类型进行选择，非洲猪瘟检测试剂盒多采用TaqMan试剂，所以这里以Taqman试剂为例进行说明。

4.设置运行条件实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面：4.1反应体积设置：建议在5-25ul，实际实验可在1-30间选择一个值，明日达和郑州中道都选择25ul体系，反应体系后面显示热盖温度为100°C；4.2反应阶段设置：根据实际使用的试剂说明书设置反应阶段及步骤，如需增加或减少PCR反应阶段，如“保温”、“PCR反应”等，可将鼠标移至反应阶段区域，点击“+”或“-”，左侧及右侧“+”分别代表在此阶段前或后增加一个阶段，中间“-”代表去掉此阶段；如需增加或减少PCR某阶段中的反应步骤，可将鼠标移至该步骤区域，点击“+”或“-”，左侧及右侧“+”分别代表在此步骤前或后增加一个步骤，中间“-”代表去掉此步骤；4.3反应温度设置：时间、温度、升温速度（熔解曲线模式）的设定可以通过在数值区输入数值或点击进行，其中温度的设置还可通过点击拖拽温度曲线中的进行温度更改，拖动时温度以1°C为单位发生改变；注意：时间设置最小值不能小于00:01秒，进行实际更改时请避免4.4信号采集的相机图标：在每个反应步骤的时间框下面都有一个信号采集的相机图标，相机图标有两种状态，当为深蓝色时，代表处于信号采集开启状态，当为浅蓝色时，代表处于信号采集关闭状态，软件默认在每个循环扩增完成后进行信号采集；根据4.1到4.4的设置方法设置好后，明日达试剂盒运行条件如下图所示：根据4.1到4.4的设置方法设置好后，郑州中道试剂盒运行条件如下图所示：4.5运行条件模板保存：设置好的运行条件，可以点击界面左上角的保存按钮后的下拉菜单，单击另存为，即会弹出保存对话框。

美国应用生物系统公司ABI Prism® 7900HT型荧光定量PCR仪操作手册目录ABI PRISM® 7900HT型荧光定量PCR仪简明手册 . 快速入门 (3)ABI PRISM® 7900HT型荧光定量PCR仪简明手册 . 绝对定量 (4)一.开机 (4)二.新建文件 (4)三.探针设置 (4)四.参数设置 (5)五.填样品表 (6)六.启动循环 (7)七.数据分析 (7)八.查看结果 (7)ABI PRISM® 7900HT型荧光定量PCR仪简明手册 . 相对定量 (9)一.开机 (9)二.新建文件 (9)三.探针设置 (9)四.参数设置 (10)五.填样品表 (11)六.启动循环 (12)七.数据分析 (12)八.设置S TUDY (12)九.查看结果 (12)ABI PRISM® 7900HT型荧光定量PCR仪简明手册 . 终点读板 (14)一.开机 (14)二.新建文件 (14)三.设置D ETECTOR和M ARKER (15)四.参数设置 (16)五.填样品表 (16)六.终点读板 (16)七.数据分析 (17)八.查看结果 (17)ABI Prism® 7900HT型荧光定量PCR仪简明手册 · 快速入门1. 开机开电脑显示屏电源，启动电脑，进入Windows NT操作系统，以用户名Administrator 登陆，密码7900。

待鼠标沙漏消失，电脑完全启动后，开7900HT电源，红橙绿灯依次闪动2次，然后绿灯点亮。

双击桌面图标，打开SDS应用软件。

2. 新建文件菜单File → New，新建一个空白文件。

Assay代表试验类型，实时定量选Absolute Quantification；终点读板选Allelic Discrimination；Container指反应板类型，根据需要选择96孔板、384孔板或微量反应卡；Template项用于调用事先设置好的模板文件；Barcode是反应板的条形码，可以用扫描仪扫入或者手工输入。

A PPLICATION N OTE利用Archimed定量PCR进行非洲猪瘟病毒检测鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司阳性对照阴性样本非洲猪瘟荧光定量PCR 分析2018年8月非洲猪瘟疫情在中国爆发，爆发地区分布交广，对我国畜牧养殖造成了巨大损失。

我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，非洲猪瘟（ASF ）是由非洲猪瘟病毒（ASFV ）引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，对生猪致病率高，致死率高达100%。

应用实时荧光PCR 技术可以从低微含毒量样品中扩增获得病毒特异性核酸片段，进行病毒鉴定。

通过扩增捕获ASFV 主要免疫原基因VP72，进而测定其核酸序列，可进行以毒株间核苷酸序列同源性比较为主要技术手段的非洲猪瘟分子流行病学研究。

利用Archimed 荧光定量PCR 进行非洲猪瘟检测一般流程为了帮助实验人员更便捷地进行非洲猪瘟检测，Archimed 定量PCR 在实验条件设置、孔板设置及数据分析等方面均进行了充分优化，力争以最智能化的方式帮助研究者完成该类型实验。

利用Archimed 软件智能设置向导，完成一个非洲猪瘟荧光定量PCR 分析实验只需简单的6个步骤：1. 创建实验：点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择相对绝对定量。

创建实验•创建新的相对定量实验文件并设置实验属性设置反应条件•进行相对定量运行条件的设置设置孔板•对反应孔进行属性及分布设置运行实验•开始非洲猪瘟荧光定量PCR 运行查看及分析结果•查看非洲猪瘟荧光定量图谱实验结果并进行分析导出实验结果•将图谱及实验数据导出保存以进行后续分析2.设置反应条件：实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面3.设置孔板：运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。

根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性注：Archimed孔板设置可以在反应运行前、运行中、或运行后设置，运行中或运行后进行孔板设置可以节省时间。

目录:1 安全预防法2 安装2。

1 交货包装2。

2 仪器的安装2.3 功能性单元2。

3.1 Mastercycler ep realplex2。

4 启动2。

4.1 realplex模块与热模块之间的连接2.4。

2 Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接2。

4.3 与其它部件的连接2。

4。

4 realplex软件的安装2.4。

4.1 安装主程序2.4.4。

2 数据恢复2。

4.4。

3 开始realplex软件的运行3。

操作3.1 管理者登陆3。

2 登陆3.3 用户变更3。

4 系统配置3。

4.1 对使用者的管理3。

4。

1。

1 新用户建立3.4.1.2 编辑用户3。

4。

1。

3删除用户3.4.2 用户层3.4。

3 循环仪3。

4.4 realplex 模块3.4.5 系统层3.4。

5。

1 特性3.4.5。

2 登陆出错信息3。

4.5。

3 用户登陆3.4。

5。

4 软件更新3。

5 检测项目管理3。

5.1 建立检测项目3。

5.2 打开检测项目3。

5.3 保存检测项目3.5.4 保存模板文件3.5。

5 模板文件的使用3.5.6 复制检测项目3。

5。

7 检测项目的输出3.5。

8 检测项目的输入3。

5.9 建立文件夹3.5。

10 删除检测项目和文件夹3.6 探针管理3。

7 染料管理3。

8 校准3.8.1 背景校准3。

8。

2 颜色校准3。

8。

2。

1 使用商业的校准工具包进行的颜色校准3。

8.2。

2 客户特有的染料的校准3.9 数据库管理3.9.1 当前数据库的自动保存3。

9.2 当前数据库的保存3。

9.3 输入数据库3.9。

4 数据库的归档4 编程（检测项目的建立）4。

1 建立一个新的检测项目4.2 建立板布局4.2。

1 染料的确定4。

2.2 参考染料的选择4。

2.3 样本容积输入4。

2。

4 探针类型的确定4.2.5 背景的确定4。

2。

6 样品类型的定义4.2。

6。

1 标准4。

2。

6。

2 阳性对照4。