作者简介：陈国怀，医学生物学工程师，主要从事诊断试剂生产和检定工作。
通讯作者：席仲兴，E-mail：xiyue8342181@sina．com ·论著·甲型副伤寒沙门菌培养条件的优化陈国怀，曹玲，罗广，刘晓，刘大东，金红燕，陈刚，席仲兴兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：优化甲型副伤寒沙门菌的培养条件，提高菌体产量。
方法通过单因素及正交试验，对影响甲型副伤寒沙门菌生长的培养温度、NaCl浓度和pH等条件进行优化。
结果甲型副伤寒沙门菌在NaCl浓度0．75%、温度35ħ、pH6．5时菌体产量最高。
结论通过对甲型副伤寒沙门菌培养条件进行优化，获得较高的菌体产量，为后期诊断试剂盒的开发奠定了基础。
关键词：甲型副伤寒沙门菌；优化培养中图分类号：Ｒ378．2+4文献标志码：A DOI：10．13309/j．cnki．pmi．2014．04．006Optimization on growth condition of Salmonella paratyphoid A CHEN Guo-huai，CAO Lin，LUO Guong，LIU Xiao，LIU DA-dong，JIN Hong-yan，XI Zhong-xing Lanzhou Institute of Biological Products Co．Ltd．，Center for Gansu Provincial Vaccine EngineeringＲresearch，Lanzhou730046，Gansu Provionce ChinaCorresponding author：XI Zhong-xing，E-mail：xiyue8342181@sina．comAbstract：Objective To optimize the growth condition of Salmonella paratyphoid A．Methods To study the effect for temperature，pH and NaCl concentration on the growth of Salmonella paratyphoid A by using the method of orthogonal d esign．Ｒesults The optimal culture condition of Salmonella paratyphoid A is NaCl concentration0．75%，temperature3 5ħand pH6．5．Conclusion The optimal culture condition of Salmonella paratyphoid A is successfully achieved in this investigation．Key words：Salmonella paratyphoid A；Optimization for cultivation肠热症是由伤寒沙门菌（Typhoidal salmonello-sis）和副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi）引起的严重肠道传染病。
在近年流行病调查结果显示，甲型副伤寒沙门菌引起的疾病所占比例逐渐升高，中国每年均有不同程度的甲型副伤寒流行及暴发［1］，需要及时采用相应的诊断试剂盒进行诊断，而诊断菌液的生产需要大规模培养菌体，副伤寒沙门菌各型要求的培养条件各不相同，在同等培养条件下，甲型副伤寒沙门菌与培养基的投入产出比值偏低。
实验中试图对甲型副伤寒沙门菌培养条件进行优化，以达到提高其菌体的产量，降低试剂盒制备的生产成本，这将对甲型副伤寒沙门菌的诊断和预防具有重要的现实意义。
1材料与方法1．1材料1．1．1菌种甲型副伤寒沙门菌菌株号为CM-CC50001，来源于中国食品药品检定研究院，由兰州生物制品研究所有限责任公司保管。
1．1．2仪器OLYMPUS CX22LED生物显微镜，购自日本OLYMPUS公司；PHSJ-5型精密pH计，上海雷磁精密仪器有限公司产品；AL104-IC电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。
电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；VS-1300L-U洁净化工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；LKB—UltrospecⅢ型分光光度计为LKB Biochrom England 产品。
1．1．3试剂与培养基培养基由兰州生物制品研究所有限责任公司培养基室提供。
盐酸、氯化钠和氢氧化钠，分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
1．2方法1．2．1菌悬液的制备将菌种开启于牛肉水中活化，经诊断用品常规培养基37ħ培养18h，取典型菌落经革兰染色镜检、生化检定与血清学试验等系列检定合格后，作为供试菌，转种于诊断用品常规培养基，收集新鲜菌苔置于生理盐水中，用中国细菌浊度标准比浊管（批号为2013-1）制成浓度为1ˑ109 cfu/mL作为试验用菌悬液。
1．2．2单因素培养条件的筛选将常规诊断用品培养基进行适当的处理后分装成若干等份，分别于31ħ、33ħ、35ħ、37ħ、39ħ、41ħ和43ħ用作培养试验。
同时分别配制成含不同NaCl浓度（0、0．1%、0．2%、0．3%、0．4%、0．5%，0．75%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%，3．0%，3．5%）的培养基；另外将培养基用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L盐酸调制成8个不同酸碱度（20ħ测定），其分别为pH4．0、pH5．0、pH6．0、pH6．5、pH7．0、pH7．5、pH8．0和pH9．0。
所有培养基经过无菌分装及0．07MPa高压灭菌30min后备用；以0．5mL的试验菌悬液分别接种到上述各培养基中培养22h，重复取样3份置于比色皿中，以空白培养基作对照调零，用分光光度计A600读数，取其平均值。
在不同的温度、NaCl浓度和pH的条件下，对甲型副伤寒沙门菌培养效果进行分析，以选择适合培养甲型副伤寒沙门菌生长的温度、NaCl浓度和pH值范围。
1．2．3正交试验设计在单因素试验获得适宜其生长的温度、NaCl浓度、pH的范围基础上，以温度、NaCl浓度、pH为因素，选三水平，以测定A600的菌浓度为指标；进行正交试验，因素水平设计见表1。
表1三因素三水平正交实验设计Tab．1The orthogonal design test including3factorsand3levels实验编号温度（ħ）pH NaCl（%）1336．00．402336．50．503337．00．754356．00．505356．50．756357．00．407376．00．758376．50．409377．00．502结果2．1温度对甲型副伤寒沙门菌生长的影响在不同的实验温度下，甲型副伤寒沙门菌培养结果见图1。
甲型副伤寒沙门菌生长浓度随着温度的升高而增加，在31ħ以上生长较快，A600值明显提高，35ħ左右时生长速度达到高峰，大于39ħ后，生长速度出现下降趋势，因此选择温度33 37ħ为适宜范围。
图1温度对甲型副伤寒沙门菌生长的影响Fig．1Effect of temperature on growth ofSalmonella paratyphoid A2．2pH对甲型副伤寒沙门菌生长的影响pH对甲型副伤寒沙门菌培养结果如图2所示。
在p H6．0 8．0时，长势较好，在pH6．5时菌液浓度A600值达到峰值0．7；即菌液浓度最高。
在pH6．0 7．0时，A600值基本达到峰值，因此，选择pH6．0 7．0为其适宜生长的pH范围。
图2pH对甲型副伤寒沙门菌的影响Fig．2Effect of pH on growth of Salmonella paratyphoid A 2．3NaCl浓度对甲型副伤寒沙门菌生长的影响甲型副伤寒沙门菌在不同的NaCl浓度下的培养结果见图3。
结果显示，NaCl浓度从0到0．5%时，细菌生长趋势基本处于增长状态，NaCl浓度为0．5%时菌浓度最大；NaCl浓度大于0．75%时生长处于下降趋势，盐浓度大于1．0%，菌浓度下降明显，对甲型副伤寒沙门菌生长不利；因此培养基中的NaCl浓度在0．4% 0．75%为甲型副伤寒沙门菌生长的适宜范围。
图3NaCl浓度对甲型副伤寒沙门菌生长的影响Fig．3Effect of NaCl on growth of Salmonella paratyphoid A2．4培养条件的优化综合单因素试验结果，选取培养温度、NaCl浓度和pH为自变量，用三因素三水平的正交分析，优化其培养条件，以菌液A600为比值，结果见表2。
结果显示，温度对甲型副伤寒沙门菌的生长影响最大，NaCl浓度次之，pH最小。
并且温度35ħ、pH6．5和NaCl浓度为0．75%时，最利于甲型副伤寒沙门菌的生长。
表2正交试验优化结果Tab．2The results of orthogonal design on growthconditions of Salmonella paratyphoid A实验编号温度（A）pH（B）NaCl（C）A600 1336．00．400．65 2336．50．500．67 3337．00．750．69 4356．00．500．79 5356．50．750．85 6357．00．400．78 7376．00．750．77 8376．50．400．73 9377．00．500．75均值10．670．740．72均值20．810．750．74均值30．750．740．77极差0．140．010．05最佳培养条件356．50．75因素主次A＞C＞B注：A、B、C分别表示温度、pH和NaCl浓度3种不同因素。
3讨论当培养基中营养物质浓度适宜时，微生物才能良好生长，营养物质浓度过低时，不能满足微生物正常生长所需；浓度过高，则可能对生长起抑制作用。
培养基的pH值必须控制在6．0 7．0的一定范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖［2］。
任何微生物都有着其特有的生长特性，细菌在培养过程中，受各种营养成分、pH和温湿度等诸多因素的影响。
对生存环境有特定严格的要求。
实验中利用正交试验就温度，NaCl浓度和pH对甲型副伤寒沙门菌的生长进行了优化。
正交试验是利用数理统计学正交原理进行合理安排的一种方法［3］。
利用一套规格化的正交表将各实验因素和各水平之间的组合均匀搭配，合理安排，可大量减少实验次数，并提供较多的信息，已在实际中广泛应用，是安排多因素实验、寻求最优水平组合，并被证明是十分有效的高效率实验设计方法。
单因素优化结果显示，甲型副伤寒沙门菌在温度33 37ħ、NaCl浓度0．40% 0．75%、pH6．0 7．0均生长较好。
