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PCR鉴定沙门氏菌血清分型方法的建立与应用赵建梅;李月华;宋传周;赵格;曲志娜【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2018(035)001【摘要】为建立快速有效、经济适用的沙门氏菌血清型鉴定方法,利用PrimerPlex 软件设计畜禽中常见沙门氏菌的菌体(O)抗原和鞭毛抗原(H)的引物,优化引物比例和退火温度等反应条件,建立沙门氏菌血清型鉴定的PCR法,并对46株沙门氏菌分离株进行血清型鉴定,同时与传统玻片凝集法和美国CDC的液相芯片(Luminex-xMAP)法进行比较.优化后获得了O抗原中B、C1、D和E1群的多重PCR引物,以及鞭毛抗原H1相抗原基因(fliC)和H2相抗原基因(fljB)的2对引物;建立了一套基于沙门氏菌O和H抗原的多重PCR血清型鉴定法;PCR法和Luminex-xMAP 法鉴定出7种沙门氏菌血清型,传统玻片凝集法鉴定出6种血清型;PCR法与传统玻片凝集法和Luminex-xMAP鉴定结果的符合率均为95.65%.本研究建立的PCR 沙门氏菌血清型鉴定法简便、快速,预期可在沙门氏菌的血清分型研究中发挥作用.【总页数】5页(P73-77)【作者】赵建梅;李月华;宋传周;赵格;曲志娜【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;平原县畜牧兽医局王庙镇动检分所,山东德州253100;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032【正文语种】中文【中图分类】S852.61【相关文献】1.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌方法的建立及初步应用 [J], 贺英;赵萍;储岳峰;高鹏程;张建军;逯忠新2.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用 [J], 贺英;赵萍;储岳峰;高鹏程;逯忠新;赵海燕3.福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法的建立及应用 [J], 罗霞;王建平;孙强正4.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及初步应用 [J], 李树清;易建平;陈志飞;王巧全;周筱华;罗满林;方怡;陈敏;夏谦5.流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用 [J], 杨振兴;李占鸿;宋子昂;李卓然;朱建波;廖德芳;杨恒因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
沙门氏菌国标检测方法一、样本采集在采集样本时，应确保采集的样本具有代表性，且无菌操作。
通常采集食品、动物粪便、环境样本等。
对于食品，应采集不同种类，如肉类、禽类、奶制品等。
对于动物粪便，应采集新鲜样本，避免受到污染。
环境样本应采集可能存在沙门氏菌的表面或水样。
二、增菌培养增菌培养是沙门氏菌检测的重要步骤，目的是增加细菌的数量，使其更容易分离和检测。
常用的增菌培养基有肉汤培养基和缓冲葡萄糖胨水培养基等。
将采集的样本接种到培养基中，在37℃下培养18-24小时。
三、分离培养将增菌培养后的培养物划线接种于选择性培养基（如SS 琼脂、麦康凯琼脂等）上，在37℃下培养18-24小时。
选择性培养基可以抑制其他细菌的生长，有利于沙门氏菌的分离。
四、初步鉴定对分离培养得到的单个菌落进行初步鉴定，包括菌落形态、染色特性、镜下形态等观察。
同时进行革兰氏染色和氧化酶试验，以初步判断是否为沙门氏菌。
五、生化试验生化试验是确定分离菌株是否为沙门氏菌的关键步骤。
常用的生化试验包括赖氨酸脱羧酶试验、尿素试验、靛基质试验等。
根据试验结果，对分离菌株进行初步分类。
六、血清学分型为了确定分离菌株的具体血清型，需要进行血清学分型。
通过与已知抗血清进行反应，确定细菌的特异性抗原，从而确定其血清型。
血清学分型对于追踪沙门氏菌的来源和传播途径具有重要意义。
七、报告结果根据以上各步骤的检查结果，综合分析并得出最终结果。
对于疑似沙门氏菌的样本，应进行复核和确认。
最终结果应以书面形式报告给相关单位或个人，报告应包括样本来源、检测方法、检测结果等内容。
同时，应对检测结果进行解释和说明，提供相应的建议和措施。
《畜产品检测技术》电子教材沙门氏菌检测血清学分型（选做）一、血清学分型操作步骤（一）O 抗原的鉴定用A～F多价O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。
在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。
1.被A～F多价O 血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果，判定O 群。
被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E4各亚群，每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O 单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O 复合因子血清进行核对。
2.不被A～F多价O 血清凝集者，先用9种多价O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O 群血清逐一检查，以确定O 群。
每种多价O 血清所包括的O 因子如下:O 多价1 A，B，C，D，E，F群(并包括6，14群)O 多价2 13，16，17，18，21群O 多价3 28，30，35，38，39群O 多价4 40，41，42，43群O 多价5 44，45，47，48群O 多价6 50，51，52，53群O 多价7 55，56，57，58群O 多价8 59，60，61，62群O 多价9 63，65，66，67群（二）H 抗原的鉴定1.属于A～F各O 群的常见菌型，依次用表1所述H 因子血清检查第1相和第2相的H 抗原。
表1A-F群常见菌型 H抗原表2.不常见的菌型，先用8种多价H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H 因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H 抗原。
8种多价H 血清所包括的H 因子如下:H 多价1 a，b，c，d，iH 多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51H 多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40H 多价4 1，2；1，5；1，6；1，7；z6H 多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38H 多价6 z39，z41，z42，z44H 多价7 z52，z53，z54，z55H 多价8 z56，z57，z60，z61，z62每一个H 抗原成分的最后确定均应根据H 单因子血清的检查结果，没有H 单因子血清的要用两个H 复合因子血清进行核对。
沙门氏菌的检验方法与注意事项在日常微生物检验中，沙门氏菌比较常见，是一种致病性细菌，国家规定在每25g的食品样本中不能检测出沙门氏菌，所以在检验沙门氏菌时，对试剂与培养基有很高的要求，下面本文针对沙门氏菌的检验方式和注意事项作出简单介绍！一、沙门氏菌检测的原因和意义根据相关统计显示，我们国家因细菌性食物中毒的人中，有70%-80%左右的人是通过沙门氏菌造成的。
人体倘若含有过多的大量沙门氏菌的动物性食物，就会造成细菌性感染，以此在毒素的影响下产生食物中毒，造成伤寒、胃肠炎及副伤寒。
而且沙门氏菌的传播途径较多，肉、蛋和其他食物，从加工至销售的整个过程当中都极易引发感染情况，所以准确、有效检验沙门氏菌有重大意义。
二、沙门氏菌的检验（一）前增菌(无选择性)BPW（缓冲蛋白胨水）属于一种比较常见的增菌培养基，不包括任何抑制物质，有助于修复受损的沙门氏菌。
促使受损的沙门氏菌细胞复苏至相对平稳的生理状态。
（二）选择性增菌TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）内含有硫代硫酸钠，结合四硫磺酸钠，能够对肠道共生菌进行有效抑制，而包含四硫磺酸钠还原酶的细菌，可以在这一培养基当中生长繁殖；煌绿及胆盐能够控制大肠群菌、革兰氏阳性菌的繁殖，而伤寒沙门氏菌依旧可以生长。
SC（亚硒酸盐胱氨酸增菌液）能够对其他和伤寒沙门氏菌进行选择性增菌，其含有的亚硒酸结合蛋白胨内的含硫氨基酸，促使亚硒酸与硫的复合物生产，对细菌硫的代谢产生干扰，进而减少肠球菌、变形杆菌、大肠埃希氏菌的繁殖生长。
（三）分离培养基(选择性)①BS（亚硫酸铋琼脂）内含亚硫酸铋指示剂，可对大肠菌群、革兰氏阳性菌进行抑制，但不会对沙门氏菌的繁殖产生影响；其他沙门氏菌、伤寒杆菌可以借助葡萄糖，还原亚硫酸铋，使其形成硫酸铋，使黑色菌落附近有黑棕色的环，对光可看到金属光泽。
BS的压力和温度不可过高，避免选择性下降，需在使用前配制，放置阴暗处储存，48小时后丧失选择性，储存不合理会造成色浅，表示效果开始减弱，联合TTB、SC使用能够提高检出率。
《畜产品检测技术》电子教材
沙门氏菌检测血清学分型（选做）
一、血清学分型操作步骤
（一）O 抗原的鉴定
用A～F多价O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。
在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。
1.被A～F多价O 血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果，判定O 群。
被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E4各亚群，每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O 单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O 复合因子血清进行核对。
2.不被A～F多价O 血清凝集者，先用9种多价O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O 群血清逐一检查，以确定O 群。
每种多价O 血清所包括的O 因子如下:
O 多价1 A，B，C，D，E，F群(并包括6，14群)
O 多价2 13，16，17，18，21群
O 多价3 28，30，35，38，39群
O 多价4 40，41，42，43群
O 多价5 44，45，47，48群
O 多价6 50，51，52，53群
O 多价7 55，56，57，58群
O 多价8 59，60，61，62群
O 多价9 63，65，66，67群
（二）H 抗原的鉴定
1.属于A～F各O 群的常见菌型，依次用表1所述H 因子血清检查第1相和第2相的H 抗原。
表1A-F群常见菌型 H抗原表
2.不常见的菌型，先用8种多价H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H 因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H 抗原。
8种多价H 血清所包括的H 因子如下:
H 多价1 a，b，c，d，i
H 多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51
H 多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40
H 多价4 1，2；1，5；1，6；1，7；z6
H 多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38
H 多价6 z39，z41，z42，z44
H 多价7 z52，z53，z54，z55
H 多价8 z56，z57，z60，z61，z62
每一个H 抗原成分的最后确定均应根据H 单因子血清的检查结果，没有H 单因子血清的要用两个H 复合因子血清进行核对。
检出第1相H 抗原而未检出第2相H 抗原的或检出第2相H 抗原而未检出第1相H 抗原的，可在琼脂斜面上移种1代～2代后再检查。
如仍只检出一个相的H 抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。
单相菌不必做位相变异检查。
3.位相变异试验方法如下:
(1)简易平板法：将0.35%～0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子
血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
(2)小玻管法：将半固体管(每管约1mL～2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H 因子血清0.05mL～0.1mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，待凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。
将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。
一般按原血清1∶200～1∶800的量加入。
(3)小倒管法：将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口，不要平齐)放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。
临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，待凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于36℃培养后再做凝集试验。
（三）Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。
已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。
（四）菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果，按照表2或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
表2常见沙门氏菌抗原表
E4 群
注：关于表内符号的说明：
{}={}内O因子具有排他性。
在血清型中{}内的因子不能与其他{}内的因子同时存在，例如在O:3,10群中当菌株产生O:15或O:15,34因子时它替代了O:1 0因子。
[]= O（无下划线）或H因子的存在或不存在与噬菌体转化无关，例如O:4群中的[5]因子。
H因子在[]内时表示在野生菌株中罕见，例如极大多数S.Para typhi A具有一个位相（a），罕有第2相（1，5）菌株。
因此，用1,2,12:a: [1,5]表示。
_=下划线时表示该O因子是由噬菌体溶原化产生的。
