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免疫组化技术 PPT

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第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)

第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用

《免疫组织化学技术》PPT课件

《免疫组织化学技术》PPT课件

PTP课件
24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
PTP课件
4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。

免疫组织化学技术-PPT精选文档

免疫组织化学技术-PPT精选文档

3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在 荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发 光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中 某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光 技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊 断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶 的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于 光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
4、被检测的物质
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、 多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病 原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA的异同
1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗 原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品 内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能 更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通 过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量 ，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组 化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原 结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。 与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首 选方法之一。

免疫组化技术ppt课件

免疫组化技术ppt课件
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗 体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋 巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合 杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体 是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从 动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；

《免疫组化技术》课件

《免疫组化技术》课件
特点
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末

免疫组化方法学课件

免疫组化方法学课件

和最低背景着色
抗体稀释度 特异性染色 背景着色 1:50 +++ + 1:100 +++ + 1:200 1:400 +++ － + － 阴性对照 － －
（4）孵育时间，加长孵育时间可有效地降低所用抗 体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体。 一般采用37℃ 1h，或4℃ 过夜
6. 二抗选用和稀释度 ⑴ 二抗常采用羊或其他动物，关键决定一抗的动物
免疫组化应用一抗大多属IgG型抗体，而IgG作为 抗原时其特异性位点在重链FC段。
2) 免疫球蛋白化学结构
抗原抗体的结合就像酶与底物结合、激素与受体 结合，不是化学反应而是非共价键可逆性结合（Ig的 抗原结合点由L和H链可变区组成，与相应抗原上的决 定族互补，借助静电力、氢键、范德华力等次级链相 结合）并受pH，温度和电解质浓度影响。
肾内源性生物素染 色假阳性
肝内源性生物素染色 假阳性
2.消除非特异性背景着色
滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液以封
闭荷电点，不给一抗留有吸附余地。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
采用二抗的同种动物的非免疫血清
多克隆抗体成分复杂，易产生背景染色，稀释液中
采用含1%BSA的 pH7.4 PBS(加0.05%NaN3防腐)，
在洗涤液中加入0.03%吐温20对消除背景也有帮助。
1. 抗原（antigen, Ag）
1) 免疫原性
2) 免疫反应性 3) 抗原分类 结构抗原 细胞骨架蛋白（中间丝）、癌基因及抗癌 基因蛋白产物 入侵抗原 病原微生物如：HPV、HBV等 分泌抗原 酶、激素、粘液蛋白 沉积抗原 免疫球蛋白、补体、免疫复合物

免疫组化技术 (2)PPT讲稿

• 二抗
▪ PAP ▪ APAAP
– 羊抗兔
– 羊抗鼠
亲和素-生物素-过氧化物酶复合 体（ABC）
• 生物素（Biotin） • 亲和素（Avidin） • 生物素标记抗体（B-Ab） • 生物素标记过氧化物酶（B-P）
亲和素-生物素-过氧化物酶复合 体（ABC）
EnVision
授课提纲 • 基质标本的制作 • 荧光免疫组化技术 • 酶免疫组化技术 • 相关问题与解决方案
免疫组化技术 (2)课件
组织化学染色技术
• Histochemistry Technique
• 观察对象
– 组织、细胞
• 使用工具
形 态
– 普通显微镜
与 结
– 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
• Immunohistochemistry Technique
– 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗 原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗 原（目的蛋白）进行定性、定位、定量测定的 一项免疫检测方法。
• 具备
– 特定部位显色 • 特定组织、特定细胞、特定结构
– 不均一显色
非特异性显色
• 主要原因
– 内源性酶 – 内源性生物素 – 抗体特异性不强 – 漂洗不充分 – 基质制作
非特异性背景显色
• 预先处理
– 加底物消耗 – 正常血清封闭
直接法
实例：细胞鉴定
• 免疫细胞及其亚群（流式细胞术）
– T细胞 • CD3+
• CD4+ • CD8+
– B细胞 – NK细胞
免疫细胞分类与计数 Helper T cell
R1
T cell / B cell
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➢荧光标记:荧光素标记抗体
•异 硫 氰 酸 荧 光 素 ( Fluorescien isothioyarale, FITC)520－530nm
•四甲基异硫氰酸罗达明(Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC) 620nm
•四 乙 基 罗 达 明 ( Teraethyle rhodamine B200, RB200)590－600nm
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min;
⑧用过氧化物酶基质液(DAB基质液)显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗,苏木素浅染,自来水冲洗还蓝, 梯度 酒精脱水,干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理: ✓组织材料的处理:
固定液为:10%中性福尔马林液; 4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PH7、4);
免疫组织化学的结果判断应特别严谨,阳性细胞 的染色分布有三种类型:胞浆型、细胞核型与细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度,并 以此作为定性、定量与定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞,并于阴性细胞间有 明显间隔,而非特异性染色常不限于单个细胞,而是累 及一片细胞,两者可显著区别。
阳性细胞的染色特征: ①阳性细胞的染色分布有三种:
AP与不同的底物(萘酚As-Mx、快蓝、快红)作用, 可形成不同颜色的终产物。用新品红(New fuchsine) 显色,可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀,不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)
HRP:底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺,产生棕色 沉淀,不溶于有机溶剂,不褪色。
以LSAB法为例简单介绍染色步骤: ①石蜡切片脱蜡－水; ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min; ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清,室温孵育 5min; ④加特异性一抗,370C孵育30－60min,or 40C过夜; ⑤加20ul生物素标记的第二抗体,370C ,30min;
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素,370C,30min;
➢胶体金: •指金的水溶胶(以微小粒子分散在水溶液中, •免疫电镜观察
主要方法: •直截了当法: •间接法:经过了第二抗体放大效应
•ABC法:
生物素(Biotin)与卵白素(Avidin)为具有高度亲 合性的物质,一个卵白素分子可结合4个生物素。 当生物素标上特定的标记物质后or与抗体结合后 仍能与卵白素结合,因此,将抗体结合上生物素, 然后与卵白素与带有特别标记物的生物素的结合 反应,而以适当方式显示。
✓合适的抗体稀释度: 过高,过低均会导致阴性结果。 即用型抗体; 浓缩型。
✓减少或消除非特异性染色的方法: 非特异性染色: 原因: 方法:
✓对比:
阳性对比:用一直抗原阳性的切片与待 测标本同时进行免疫细胞化学染色,阳性对比应 呈阳性结果,即为阳性对比。
阴性对比:用不含一直抗原的标本作对 比,实验结果为阴性,即为阴性对比。阴性对比 中还包括空白对比、替代对比、吸收与抑制对 比等,用以排除假阳性结果。
分布,定位,定量;
蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
材料:
•抗体:
✓多克隆抗体:为针对多个抗原决定簇的抗 体, 为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
✓有限的抗原决定簇,特异 性强。
显示物:
➢酶标反应:
①碱性磷酸酶(Alkatine phasphotase,AP)
单核细胞,粒细胞表面。 CD20: B细胞标记物。 CD45RO、CD3:T细胞标记物。 CD57:为自然杀伤细胞的标记物。 CD38:为浆细胞的标记物。 CD68:主要标记各种组织中的巨噬细胞。
神经内分泌标记物: 嗜铬素A(Chromogranin, CgA):
存在于神经元,神经内分泌细胞及其肿瘤中。 突触素(Synaptophysin, Sy):
固定时间:8-24hr 组织大小:2*1、5*0、3cm
✓防脱片处理: 多聚-L-赖氨酸; 硫酸铬钾明胶液。
✓增强特异性染色的措施与方法: 1)蛋白酶消化:a、胰蛋白酶消化
(0、05-0、1%); b、胃蛋白酶消化(0、4%)。 2)热诱导的抗原修复: 方法:微波960C, 10min; 直截了当加温方法 1000C, 10min; 高压锅 1200C, 10min; 热处理液:0、01mol/L PH6、0 柠檬酸缓冲液
存在于神经元突触前囊泡膜上,肾上腺髓质细胞, 神经内分泌细胞中。 髓磷脂硷性蛋白(Myelin basic protein, MBP):
激素及激素受体类标记: 雄激素受体(Androgen receptor, AR): 雌激素受体(Estrogen receptor, ER) 孕激素受体(Progesterone receptor, PR): 垂体激素:
S-P法(LSAB):
采纳生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素(底物)混合液来测定 细胞与组织中的抗原。
Envision:
原理:第二抗体上标记有多聚物酶(HRP or AP)复 合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的 HRP分子,使信号有显著提高,敏感性较PAP法,ABC法高 出几十倍,背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在,无非 特异性干扰,尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育 时间短,该方法更省时,简便。
胞浆;细胞核;细胞膜表面 ②阳性细胞分布:灶性;弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘,刀痕or组织折叠,坏死,挤压区,胶 原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
关于阳性结果的定量判断: -,+,++,+++等分级与计数统计
淋巴细胞标记物: 白细胞共同抗原(LCA, CD45):主要分布于T, B细胞,
组织化学技术
组织化学的基本概念:
组织化学:组织水平,对组织内存在的各种物质 进行定性、定量以及其局部的与移动的部位分析 的方法
• 免疫组织化学:基于抗原抗体反应
• 酶组织化学
疾病的病理学研究概括起来主要在基因与蛋白 水平上进行的研究。
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
蛋白表达=>