荧光PCR技术在病毒检测中的应用

安徽医药Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１６　Ｓｅｐ，２０（９）　・１７２３・　

不同荧光定量ＰＣＲ技术在乙型肝炎病毒检测中的应用评价　

朱明岩，叶英　（安徽医科大学第一附属医院感染病科，安徽合肥２３００２２）　

摘要：目的评价普通荧光定量ＰＣＲ技术与罗氏内标法荧光定量ＰＣＲ技术在乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）检测中的意义。方法采　集ＨＢＶ患者的血清１９０份，分别用两种方法进行检测，通过相关性分析和Ｋａｐｐａ检验评价两种试剂检测结果之间的差异性及　

一致性。结果（１）１９０份标本中，罗氏Ｃｏｂａｓ试剂与国产试剂检测结果呈线性相关（Ｒ　＝０．６７０　７，Ｐ＜０．０５）；（２）分成ＨＢｅＡｇ　（＋）与ＨＢｅＡｇ（一）两组比较，两组中Ｃｏｂａｓ试剂与国产试剂检测均呈线性相关（Ｒ　＝０．５８６　４，Ｐ＜０．０５；Ｒ　＝０．５２２　６，Ｐ＜　０．０５）；（３）根据不同ＨＢｅＡｇ状态和抗病毒要求的ＤＮＡ载量对标本进行一致性分析，ＨＢｅＡｇ（＋）组Ｋａｐｐａ值为０．７５２；ＨＢｅＡｇ　（一）组Ｋａｐｐａ值为０．３８１。结论对于ＨＢｅＡｇ（＋）患者，可以应用国产试剂检测患者的ＨＢＶ．ＤＮＡ水平，而对于ＨＢｅＡｇ（一）　患者，建议应用Ｃｏｂａｓ试剂检测其患者的ＨＢＶ—ＤＮＡ水平。　关键词：乙型肝炎病毒；多重聚合酶链式反应；荧光抗体技术　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—６４６９．２０１６．０９．０３１　

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　

ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ＨＢＶ－ＤＮＡ　

ＺＨＵ　Ｍｉｎｇｙａｎ，ＹＥ　Ｙｉｎｇ　（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＡｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　

Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ　２３００２２，Ｃｈｉｎａ）　

1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用

荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。

1. 原理：

荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。

随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。

2. 方法：

主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。

探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。

SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。

3. 注意事项：

荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。 反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。

荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。

4. 在临床与科研中的应用：

在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。

在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。

总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

广东医学２０１１年ｌ０月第３２卷第ｌ９期　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｃｔ．２０１１，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１９　

荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ在检测流感病毒中的应用　

李文悌　，孙菲　，王晓春　

中南大学湘雅医学院医学检验系（长沙４１００１３）；　湖南国际旅行卫生保健中心（长沙４１０００７）　

流感病毒（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ）是一类具有高度传染性的呼　

吸道病毒，是线状单股负链ＲＮＡ病毒，根据核蛋白和基质蛋　

白的抗原性，流感病毒可以分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）３种　类型。甲型流感病毒基因经常发生突变，造成不同程度的季　节性流感流行和流感大流行…。在２００９年首发于北美的新　

甲型Ｈ　Ｎ　病毒短时间内席卷全球，此病毒传染性极强，　

ＷＨＯ在８月６日公布最新疫情，截至２０１０年８月１日，全　球新甲型Ｈ　Ｎ。造成的死亡病例超过１８　４４９例。８月１０日，　ＷＨＯ总干事宣布全球进入“流感大流行后期”。９月份，卫　

生部推出新流感监测方案，将进一步优化全国流感监测工　

作，提升监测水平和质量。建立快速、准确的检测方法从而　

进行早期诊断是监测并控制疫情蔓延的方式之一。目前快　速检测流感病毒的方法有逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ—　

ＰＣＲ）、荧光定量ＲＴ～ＰＣＲ（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｌｉｔ—ＰＣＲ）、依赖核酸　序列的扩增技术、基因芯片技术、间接荧光抗体实验和酶联　

免疫吸附实验等，其中ｌｉｔ—ＰＣＲ和荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ是研　

究的热点。本文就荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ在检测流感病毒中的　

应用做一综述　

１　荧光定量ｌｉＴ—ＰＣＲ技术的介绍　

ｌｉｔ—ＰＣＲ是以ＲＮＡ为模板，依靠逆转录酶的作用，以４　

种ｄＮＴＰ为底物合成互补ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ，ｅＤＮＡ）　链，然后以ｃＤＮＡ链为模板进行ＰＣＲ的过程。荧光定量　ＲＴ—ＰＣＲ是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团（染料或探　

针），利用荧光信号积累实时检测整个ＰＣＲ进程，最后通过　标准曲线对未知模板进行定量分析的方法　Ｊ。　

新型冠状病毒的检测方法主要包括核酸检测，抗体检测和抗原检测。由于抗原检测的检测率低，新冠的检测主要集中在抗体和核酸检测上。核酸检测是新型冠状病毒检测的金标准，具有早期诊断，敏感性和特异性的特点。但是，抗体检测方便快捷，可以用作核酸诊断的补充手段。但是，由于抗体检测的“假阳性”和“假阴性”的局限性，因此不适于一般人群的筛查，例如重返工作和重返校园，以及在低流行地区进行流行病学调查。

新型冠状病毒的检测方法主要包括核酸检测，抗体检测和抗原检测。由于抗原检测的检测率低，新冠的检测主要集中在抗体和核酸检测上。核酸检测新型冠状病毒检测是目前检测新型冠状病毒的“黄金标准”。具有早期诊断，高灵敏度和高特异性的特点。但是抗体的检测是方便且快速的，并且可以用作核酸诊断的补充方法。但是，由于“假阳性”和“假阴”的局限性，该筛查不适用于一般人群筛查，例如康复，康复和康复。低流行地区的流行病学调查。

检测原理

除病毒外，所有生物均包含核酸，包括DNA和RNA。新型冠状病毒（2019-nCoV）属于Beta冠状病毒（Betacoronavirus），它是被蛋白质包裹的单链正链RNA病毒，可感染并感染高等动物（包括人）。新型冠状病毒是已经通过RNA鉴定的新型冠状病毒。新的DNA序列已被中国科学家成功鉴定。如果可以在怀疑的患者中检测到新的冠状病毒，则可以认为该患者可能被新的冠状病毒感染。新型冠状病毒通常用于核酸诊断。有两种方法：病毒核酸特异性基因检测和病毒基因组测序。通过荧光定量PCR（聚合酶链反应）检测到新的冠状病毒特异性核酸序列。由于新型冠状病毒是RNA，因此该检测试剂盒基于实时逆转录和实时聚合酶链反应（RT-PCR），扩增病原体的核酸（RNA）以及实时检测扩增的病毒产品由荧光探针制成。在PCR反应系统中，包括一对特异性引物和TaqMan探针。探针是特定的寡核苷酸序列，探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完成后，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；如果反应系统中有靶序列，则在PCR反应中探针与模板结合，DNA聚合酶利用酶的酶活性沿模板裂解探针，将报道基团与淬灭的分子分离组发出荧光。对于每条扩增的DNA链，都会产生一个荧光分子。荧光定量PCR可以检测到达到预设阈值的荧光的循环数（CT值）与病毒核酸的浓度有关。病毒核酸的浓度越高，CT值越小。不同制造商的产品将根据自己的产品性能确定产品的正面判断价值。