荧光定量pcr技术及在动物疫病检测中的应用

１４３６　临床肺科杂志２００８年Ｉ１月　第ｌ３卷第１１期　

探讨荧光定量ＰＣＲ在结核菌检测中的应用　

李洪敏王治伟　张霞苗青刘银萍　

【摘要】　目的探讨荧光定量ＰＣＲ技术在检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法通过荧光定量ＰＣＲ技术鉴　定３５０株临床分离株，进行结核分枝杆菌的菌种鉴定和定量分析，同时进行抗酸染色和培养法。结果荧光定量ＰＣＲ、染色和培　养法阳性检出率分别为３８．８％（１２８／３３０），２１．８％（７２／３３０），２９．７％（９８／３３０），提高阳性检出率（涂阴）１６．９７％（５６／３３０），菌种　鉴定特异性实验符合率为１００％。结论荧光定量ＰｅＲ技术是一种快速、敏感、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法。　【关键词】结核分枝杆菌；荧光定量ＰｅＲ；定量分析；菌种鉴定　

Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ－ＦＱ－ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｉ－ｌｏｎｇ—ｒａｉｎ，吼ⅣＧ　Ｚｈ　—ｗｅｉ，　Ｚ融ⅣＧ疵０，ｅｔ　ａ１．　２ｔｈ　Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂ　Ｂｅ　１０００９１　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｄｉｓｃｕｓｓｅｓ　Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ—ＦＱ—ＰｅＲ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎ　ｏｆ　Ｍ　ｔｕｂｅｒ－　ｃａｌｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄ　Ｉｄｅｎｔ／ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｒｅａ１　ｔｉｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｂｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　３５０　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ—ＦＱ—ＰＣＲ．ａｃｉｄ－ｆａｓｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｄｏｎｅ　ａｓ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔ　ｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ—ＦＱ—ＰｅＲ、ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｓ　３８．８％（１２８／３３０），２１．８％（７２／３３０），２９．７％（９８／３３０）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｗａｓ　ｂｅｅｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　１６．９７％（５６／３３０）ｈｉ【ｇｈ　ｔｈａｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｔｈｅ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ—ＦＱ—ＰＣＲ　

荧光定量PCR技术及其在生物检测中的应用穆惠　童朝阳【摘要】　荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术。该技术在PCR反应体系中

引入了荧光标记的探针,具有高度的灵敏性、特异性和精确性等特点。荧光定量PCR技术根据其探针

的作用方式分为:Taqman技术、Amplisensor技术、Molecularbeacon技术、复合探针法、ScorpionsTM探

针技术、AmplifluorTM通用检测系统、SYBR荧光染料等类型。目前该技术已广泛应用于HBV病毒、

HCV病毒、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、寄生虫、病毒感染的定量监测、食品卫生

检疫等生物检测领域。

【关键词】　荧光定量PCR　荧光探针　生物检测

1　前言

多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是本世

纪核酸分子生物学研究领域最重大的发明之一,该技术曾获

1993年诺贝尔奖,已广泛用于基因克隆、临床基因诊断、环境

卫生检测等领域,但常规PCR技术具有许多局限性,主要表

现在:1)PCR完毕后,需要对PCR产物进行凝胶电泳分析,

不能对PCR的过程进行实时监测;2)不能进行定量监测;3)

容易交叉污染,产生假阳性。荧光定量PCR技术(简称FQ-

PCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种

新的PCR技术,它通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利

用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线

对未知模板进行定量分析的方法[1]。它的出现不仅实现了

PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特

异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目

前已广泛应用于基因表达研究、转基因研究、病原体定量检

测、药物疗效考核、疾病分类及其发病机理的研究、新药验证

等领域。本文综述国内外荧光定量PCR技术的研究进展,为

能在军民两用上广泛开发应用此技术打下基础。

2　荧光定量PCR技术的基本原理

安徽农学通报，Ａｎｈｕｉ　Ａｇａ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌ１．２００８，１４（２３）　１６３　

荧光ＰＣＲ技术在动物医学中的应用　

刘　捌　

（南京农业大学动物医学院，江苏南京２１００９５）　

摘要：荧光ＰＣＲ技术是利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术，与普通的ＰＣＲ技术相比．荧光ＰＣＲ　技术具有特异性强、灵敏度高、无污染和快速等优点。近几年，荧光ＰＣＲ技术在动物医学中得到了广泛的应用，　本文着重介绍其在细菌性和病毒性疫病的诊断中所发挥的作用。　关键词：荧光ＰＣＲ；动物疾病；诊断　

中图分类号０６５７　文献标识码Ａ　文章编号１００７—７７３１（２００８）２３—１６３—０２　

荧光ＰＣＲ技术是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基　

团，利用荧光信号积累实时检测整个ＰＣＲ进程，最后通　

过标准曲线对未知模板进行定量的方法。该技术是近年　

发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸的技术　［１］，它具有敏感性高、重复性好、速度快、自动化程度　

高和污染少等优点　，并且可以提高检测效率，缩短检　

测周期，提高经济与社会效益。近年来，荧光ＰＣＲ技术　

应用范围越来越广，特别是在动物医学中的应用得到了　

进一步发展。　

１对细菌病的诊断　

１．１猪链球菌猪链球菌是一种重要的人兽共患病的　

病原菌，主要引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血　

症等疾病，严重危害养猪业的发展。根据猪链球菌的荚　膜多糖抗原（ｃｐｓ）可将其分为３５个血清型，即ｌ一３４　

型和ｌ／２型，其中能引起人和动物发病的血清型主要是　

１型（ＳＳ１）、２型（Ｓｓ２）、７型（Ｓｓ７）和９型（　

ＳＳ９）　。用传统的微生物学病原分离技术结合血清学试　验，能够对猪链球菌进行诊断和血清学分型，但该方法　

费时费力且敏感性不高，易产生非特异性结果。拜廷阳　等　建立了ＳＳ９水解探针（ＴａｑＭａｎ）模式的荧光实时定　

量ＰＣＲ检测方法，与常规ＰＣＲ方法相比，该方法诊断　

更加迅速，整个反应可在１—２　ｈ内完成，且不需要电　

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析

而实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进行定量分析的方法。

目前，实时荧光定量 PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。

实时荧光定量PCR的应用

目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：

● 基因扩增

● 扩增特异性分析

● 基因定量分析

● 基因检测

● 基因分型

● SNP分析 ● RFLP多态性分析

● 单/多基因表达研究

● 高通量基因表达谱研究

……

实时荧光定量PCR的常用方法

染料法

荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。

常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。

Promega采用新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强.

探针法

在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。