实时荧光定量PCR技术在病毒载量监测中的应用

《上海畜牧兽医通讯》２０１４年第５期　・　１１　・　

蓝舌病病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测技术　

的建立及初步应用　

肖　雷　姚　俊　孟锦昕　李　楠　高　林　何于雯　李华春　朱建波　

（云南畜牧兽医科学院６５０２２４）　

蓝舌病最早于１９０５年发现于南非，主要存在于　

南纬４０。至北纬５３。之间的地区，包括美洲、非洲、澳　洲以及亚洲。我国自１９７９年在云南分离到蓝舌病　

病毒以来，湖北（１９８３）、安徽（１９８５）、四川（１９８８）、　山西（１９９３）、广西（１９８５）等省份分别报道发现了蓝　

舌病，此后蓝舌病普查中有２９个省（市、地区）发现　

该病ｎ　。２００６～２００８年蓝舌病相继出现在荷兰、卢　森堡、丹麦、瑞士、捷克以及英国，同年受到感染的　

动物被进口到了意大利。２００８年１月，在西班牙检　

测到感染了ＢＴＶ一８的动物，蓝舌病的分布范围进一　

步扩大，引起广泛关注，很多国家开始了深入研　

究　。蓝舌病（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＢＴ）是由蓝舌　病病毒（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ，ＢＴＶ）引起的主　

要侵害绵羊或牛等反刍动物的一种非接触性传染　

病，主要由库蠓对其反刍动物宿主的叮咬而传播，　

绵羊、山羊和牛是本病的主要易感动物，骆驼及野　生反刍动物（如白尾鹿、驼鹿、又角羚、羚羊）等均能　

感染本病，其病症是颊黏膜和胃肠道黏膜严重的卡　

他性炎症，感染动物精神沉郁，食欲丧失，常出现血　

样下痢，常因蹄冠上皮脱落而跛行，被毛断裂，甚至　

全部脱落。ＢＴＶ属呼肠孤病毒科环状病毒属，毒粒　

子呈二十面立体对称，基因组由１０个节段的双股　

ＲＮＡ组成，编码７种结构蛋白（ＶＰ１～ＶＰ７）和４种　

非结构蛋白（ＮＳ１、Ｎｓ２、ＮＳ３ａ、ＮＳ３ｂ），其中，Ｓ７编　

码的ＶＰ７、Ｓ１编码的Ｍ６较为保守　。　

目前，蓝舌病尚无十分有效的预防和治疗方　

法　。早发现、早处理，将损失降到最低，这就需对　

蓝舌病病原进行快速诊断和检测。荧光定量　

实时荧光定量PCR简介及其在食品检测领域中应用

摘要：实时荧光定量PCR 是在定性PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术；该技术不仅实

现对DNA 模板定量，且具有灵敏度高、特异性强、无污染性、及实时性和准确性等特点。该文主要介绍实时荧光定量PCR 原理和在食品检测中应用，及其在食品领域发展前景。

关键字：荧光定量PCR；致病菌检测；转基因食品检测

Abstract：Real–time fluorogenic quantitative polymerase Chain Reaction is a quantitative nucleic

acids technology based on quanlity PCR，with characteristics of high sensitivity and specificity，pollution–free，instantaneity and accuracy as well as realization for quantitation of DNA template. its

principle and application in food detection have been introduced in this article，and its prospect in food

field predicted.

Key word：real–time quantitative PCR；pathogen detection；genetically modified food detection

一、实时荧光定量PCR技术原理

实时定量荧光PCR技术是从传统 PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量的体系。PCR反应过程产生DNA拷贝数，随反应循环数增加，以呈指数方式增加逐渐转入平台期。在传统PCR中，用终点法对PCR产物定量有不足之处；而在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，加入的荧光物质具有特定的波长，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

62 信息·技术信息记录材料 2018年3月 第19卷第3期

5 医院信息化存在的作用医院存在我们城市的角角落落，是人流量挺多的地方，因此，他的管理需要我们更加系统化，随着我们信息科技的发展我们医院信息化建设的工作也是逐渐的在进行发展，而医院信息化的建设成为我们医院管理的重要手段。改革了曾经的管理制度，让我们医院的更加系统化，改变了原来的传统工作方式，减少了不必要的一些环节，让每一个信息更加准确话，减少了一些错误的工作笔记，让医院的管理更加规范化，标准化，病人在医院治疗疾病时也可以更加放心，提高了医院在病人心中的信誉，让更多的医院有竞争力。竞争力可以让更多的医院继续保持进步，提高自己医院的建设，缓解近几年来医户人员和病人之间的危险关系，让中国的医疗发展走上可持续发展的道路。6 结语综合医院信息化建设的各项研究表明综合性信息化医院建有利于医院未来的可持续性发展， 社会在不停的进步与发展，我们的医院也应该追上时代的步伐，高质量的信息系统化建设为我们的安全提供更多的保障，这也符合我们任何人的生命安全需求，不如让我们一起来努力，逐步发展综合性医院信息化建设，让我们中国的所有医院都能够得到很好的改革，每一个病人都能得到最好的医疗照顾，医院也可以得到更好的经营与管理。【参考文献】[1]李包罗.医院管理学.信息管理分册[M].北京:人民卫生出版社，2003：34.[2]郑小华数字化医院整体解决方案及管理模式[J].中华医院信息网络大会论文集，2007.[3]谭郁彬，张乃鑫.外科诊断病理学[M].天津:天津科学技术出版社，1058.2000.1 引言在我国，由于转基因技术的逐渐成熟化，以前转基因农作物还停留在实验阶段，目前开始在具体的环境中得到利用。油菜籽、玉米、大豆以及棉花是百分之九十五的转基因农作物都集中于此。而且很多的农作物已经实现了生产上的商品化，其种植面积不断扩大化。作为粮油质检机构，就要在转基因检测中遵循准确、快速以及简便的原则进行，在定量以及定性进行进口转基因物的检测技术进行加强，就要确保监督管理食品的安全性。当前对待转基因的食品，人们越来越重视，而且更加重视其建立相关的转基因成分标签制度，提高了更为严格的定量分析要求。在检测转基因的过程中采用传统的PCR技术进行定性分析，因为反应抑制、不适当的操作以及高敏感性差导致假阳性的出现，传统的方法已经满足不了现在的检测要求。因为科学技术的成熟化，实时荧光定量PCR技术的不断创新，其操作简单、特异性强、具有很高的灵敏度，可以定量地分析DNA模板，而且可以实时地检测、没有产生污染、结果准确度高以及可以实现自动化等优势。2 实时荧光定量PCR技术 2.1 实时荧光定量传统PCR技术是可以定性进行，随着发展出现了实时荧光定量PCR技（(Realtime PCR），它可以实现定量核酸的技术。在美国AppliedBiosystems公司此技术就是由此开始的，就是利用荧光基团加入到PCR的反应体系中，而且检测的荧光信号强度以及DNA数量关系是线性相关。可以实时地对整个PCR进程在荧光信号的积累下进行检测，进一步DNA扩增曲线就刻意得到，对于定量分析未知模板时其中之一的方式就是可以利用标准曲线进行。在PCR反应中，DNA拷贝数就会产生，而且增大反应循环数，DNA拷贝数增加是以指数的形式进入到平台期，实时荧光定量PCR技术和传统的PCR技术相比较，由于传统上定量分析PCR采用终点法存在缺陷，但实时技术可以弥补其缺陷，可以实时地在PCR反应扩增中进行检测，而且荧光信号经过连续的分析，就会扩增，当荧光信号被检测出，就会得到曲线。所以指数期间时PCR反应可以进行对PCR产物量的检测，在某一个点进行，进一步对模板的起始含量进行推断。实时荧光定量PCR反应时，处于指数期，为了更为对样本进行检测，要进行荧光信号阈值的设置，而且荧光的本底信号是基于PCR反应之前的循环荧光信号进行，数量确定15个。样本的域值循环数Ct就可以用此进行定义，其模板的Ct值和模板起始拷贝数对数是线性相关，Ct值随着起始拷贝数的增加值越来越小。对于未实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用【摘要摘要】随着我国在转基因粮油上的产量增加，造消费作物上随之增加，在作物的进行育种中，更为广泛地采用转】随着我国在转基因粮油上的产量增加，造消费作物上随之增加，在作物的进行育种中，更为广泛地采用转基因技术，所以对我们而言在检测粮油转基因物的成分时，就要分析其技术。随着技术的发展，出现了一种可以实时地技术，由于优势很多广泛地应用在粮油检测中。基于此本文对实时荧光定量PCR检测的技术-实时荧光定量PCR技术进行分析，重点对其在粮油转基因成分检测中的应用进行阐述，以供参考。【关键词关键词】实时荧光定量】实时荧光定量PCR；粮油；转基因成分；应用【中图分类号中图分类号】TS201 【】TS201 【文献标识码文献标识码】A 【】A 【文章编号文章编号】1009-5624（2018）03-0062-02】1009-5624（2018）03-0062-02马颖颖（大连工业大学 辽宁 大连 116600）

城乡与环境　

●　—Ｉ：ｈｎｏ　ｌ　ｏｇｖ　Ｖ　Ｉ｝．１　ｎ＿．ｓ　！ｐｎｃ０　ａｌ１ｄ　１、０　Ｒｅ　ｌ　Ｐ　。＇Ｃ）●口■■　

实时荧光定量ＰＣＲ技术在出入境检验　

检疫巾的应用研究进展　

薛银刚陈军宋白薇石建华鞠慧萍郑晨　

（苏州出入境检验检疫局　汀苏　苏州Ｉ　２Ｉ　５１０４）　

中图分类号：Ｒ１１　５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９　９１４Ｘ（２０１０）０３—０００１一Ｏ１　

１荧光定量ＰＱＲ技术在植物病害早期诊断中的应用　荧光定量ＰＣＲ反应体系最初以ＤＮＡ插入式染料溴化乙锭作为发光物质，　

逐渐发展出更灵敏的ＤＮＡ染料以及荧光探针，根据发光原理主要分为两大　

类：染料法和探针法。荧光定量Ｐ　Ｃ　Ｒ技术以其特异好、灵敏度高、快速　

简便和可定量定性等特点，目前已开始应用于植物病害的检验检疫中。　

１　１植原体导致的植物病害上的应用　

荧光定量ＰＣＲ用于检验检疫已经有段时间，但最近几年才被用于植物病　原菌质体即植物原体的检测。如洋葱黄化病（Ｗｅｉ　ｅｔ　ａ１．，２００４）、菊　

花黄化病植原体（Ｍａｒ　ＺａＣｈｉ　ｅｔ　ａ１．，２００５）和苹果丛生植原体的检测　

（Ｙ０ｒｒｅ　ｓ　ｅｔ　ａ１．，２００５），此外Ａｎｇｅ１ｊ　ｎｉ等人（２００７）利用ＹａｑＭａＩＩ　

探针以及根据植原体ｌ６ｓ核糖体ＲＮＡ设计的引物对葡萄藤黄化病进行检验，　使检测过程相对于传统ＰｃＲ而言缩短了检测时间，增加了方法的特异性和灵　

敏性。因此利用荧光定量ＰＣＲ可以对植原体进行分类鉴定，从而提高出入　

境检验检疫的效率。　

１　２病毒导致的植物病害上的应用　

烟草环斑病毒ＴＲＳＶ是中国公布的二类禁止进境检疫有害生物，它可侵　染５４科３　００多种植物，自然寄主有豆类、花卉、果树和烟草等重要经济　

作物，其传播途径多，危害性大。因此对于ＴＲｓｖ的检验检疫显得尤为重　

要（黄江华等，２　０　０　８）。杨伟东等（２　０　０　６）首次应用免疫捕捉反转录实　时荧光ＰＣＲ技术检测ＴＲＳＶ，由ｊ　综合运用了抗原体特异性结合、核酸分子