实时荧光PCR技术在病毒检测中的应用研究

《上海畜牧兽医通讯》２０１４年第５期　・　１１　・　

蓝舌病病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测技术　

的建立及初步应用　

肖　雷　姚　俊　孟锦昕　李　楠　高　林　何于雯　李华春　朱建波　

（云南畜牧兽医科学院６５０２２４）　

蓝舌病最早于１９０５年发现于南非，主要存在于　

南纬４０。至北纬５３。之间的地区，包括美洲、非洲、澳　洲以及亚洲。我国自１９７９年在云南分离到蓝舌病　

病毒以来，湖北（１９８３）、安徽（１９８５）、四川（１９８８）、　山西（１９９３）、广西（１９８５）等省份分别报道发现了蓝　

舌病，此后蓝舌病普查中有２９个省（市、地区）发现　

该病ｎ　。２００６～２００８年蓝舌病相继出现在荷兰、卢　森堡、丹麦、瑞士、捷克以及英国，同年受到感染的　

动物被进口到了意大利。２００８年１月，在西班牙检　

测到感染了ＢＴＶ一８的动物，蓝舌病的分布范围进一　

步扩大，引起广泛关注，很多国家开始了深入研　

究　。蓝舌病（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＢＴ）是由蓝舌　病病毒（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ，ＢＴＶ）引起的主　

要侵害绵羊或牛等反刍动物的一种非接触性传染　

病，主要由库蠓对其反刍动物宿主的叮咬而传播，　

绵羊、山羊和牛是本病的主要易感动物，骆驼及野　生反刍动物（如白尾鹿、驼鹿、又角羚、羚羊）等均能　

感染本病，其病症是颊黏膜和胃肠道黏膜严重的卡　

他性炎症，感染动物精神沉郁，食欲丧失，常出现血　

样下痢，常因蹄冠上皮脱落而跛行，被毛断裂，甚至　

全部脱落。ＢＴＶ属呼肠孤病毒科环状病毒属，毒粒　

子呈二十面立体对称，基因组由１０个节段的双股　

ＲＮＡ组成，编码７种结构蛋白（ＶＰ１～ＶＰ７）和４种　

非结构蛋白（ＮＳ１、Ｎｓ２、ＮＳ３ａ、ＮＳ３ｂ），其中，Ｓ７编　

码的ＶＰ７、Ｓ１编码的Ｍ６较为保守　。　

目前，蓝舌病尚无十分有效的预防和治疗方　

法　。早发现、早处理，将损失降到最低，这就需对　

蓝舌病病原进行快速诊断和检测。荧光定量　

城乡与环境　

●　—Ｉ：ｈｎｏ　ｌ　ｏｇｖ　Ｖ　Ｉ｝．１　ｎ＿．ｓ　！ｐｎｃ０　ａｌ１ｄ　１、０　Ｒｅ　ｌ　Ｐ　。＇Ｃ）●口■■　

实时荧光定量ＰＣＲ技术在出入境检验　

检疫巾的应用研究进展　

薛银刚陈军宋白薇石建华鞠慧萍郑晨　

（苏州出入境检验检疫局　汀苏　苏州Ｉ　２Ｉ　５１０４）　

中图分类号：Ｒ１１　５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９　９１４Ｘ（２０１０）０３—０００１一Ｏ１　

１荧光定量ＰＱＲ技术在植物病害早期诊断中的应用　荧光定量ＰＣＲ反应体系最初以ＤＮＡ插入式染料溴化乙锭作为发光物质，　

逐渐发展出更灵敏的ＤＮＡ染料以及荧光探针，根据发光原理主要分为两大　

类：染料法和探针法。荧光定量Ｐ　Ｃ　Ｒ技术以其特异好、灵敏度高、快速　

简便和可定量定性等特点，目前已开始应用于植物病害的检验检疫中。　

１　１植原体导致的植物病害上的应用　

荧光定量ＰＣＲ用于检验检疫已经有段时间，但最近几年才被用于植物病　原菌质体即植物原体的检测。如洋葱黄化病（Ｗｅｉ　ｅｔ　ａ１．，２００４）、菊　

花黄化病植原体（Ｍａｒ　ＺａＣｈｉ　ｅｔ　ａ１．，２００５）和苹果丛生植原体的检测　

（Ｙ０ｒｒｅ　ｓ　ｅｔ　ａ１．，２００５），此外Ａｎｇｅ１ｊ　ｎｉ等人（２００７）利用ＹａｑＭａＩＩ　

探针以及根据植原体ｌ６ｓ核糖体ＲＮＡ设计的引物对葡萄藤黄化病进行检验，　使检测过程相对于传统ＰｃＲ而言缩短了检测时间，增加了方法的特异性和灵　

敏性。因此利用荧光定量ＰＣＲ可以对植原体进行分类鉴定，从而提高出入　

境检验检疫的效率。　

１　２病毒导致的植物病害上的应用　

烟草环斑病毒ＴＲＳＶ是中国公布的二类禁止进境检疫有害生物，它可侵　染５４科３　００多种植物，自然寄主有豆类、花卉、果树和烟草等重要经济　

作物，其传播途径多，危害性大。因此对于ＴＲｓｖ的检验检疫显得尤为重　

要（黄江华等，２　０　０　８）。杨伟东等（２　０　０　６）首次应用免疫捕捉反转录实　时荧光ＰＣＲ技术检测ＴＲＳＶ，由ｊ　综合运用了抗原体特异性结合、核酸分子　

第1篇

一、实验目的

1. 通过实时荧光定量PCR技术，检测新冠病毒（SARS-CoV-2）核酸在样本中的含量。

2. 了解实时荧光定量PCR技术的原理及操作步骤。

3. 掌握实时荧光定量PCR仪器的使用方法。

二、实验原理

实时荧光定量PCR技术是一种基于PCR原理的核酸定量方法。通过在PCR反应体系中加入荧光标记的寡核苷酸探针，当目标DNA被扩增时，探针与目标DNA结合，荧光标记被激发并产生荧光信号。通过实时监测荧光信号的变化，可以实现对目标DNA的定量分析。

三、实验材料

1. 实时荧光定量PCR仪器：型号为YT-PC48。

2. 样本：新冠病毒阳性对照、阴性对照、待测样本。

3. PCR试剂：包括引物、探针、dNTPs、Taq酶等。

4. 仪器耗材：48孔PCR板、离心管、移液器等。

四、实验方法

1. 样本处理：将新冠病毒阳性对照、阴性对照、待测样本分别提取核酸，进行核酸浓度测定。

2. PCR反应体系配置：根据实验要求，配置PCR反应体系，包括模板DNA、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。

3. PCR反应：将配置好的PCR反应体系放入实时荧光定量PCR仪器中进行扩增。

4. 数据采集与分析：实时监测荧光信号的变化，绘制荧光曲线，分析实验结果。

五、实验结果

1. 核酸提取：新冠病毒阳性对照、阴性对照、待测样本的核酸浓度分别为1.0×10^6 copies/μL、1.0×10^5 copies/μL、1.0×10^4 copies/μL。 2. PCR反应：在实时荧光定量PCR仪器中，对配置好的PCR反应体系进行扩增。

3. 数据采集与分析：实时荧光定量PCR仪器实时监测荧光信号的变化，绘制荧光曲线。结果如下：

（1）新冠病毒阳性对照：荧光曲线呈现典型的S形，扩增效率高，Ct值低，表明样本中含有新冠病毒核酸。

（2）阴性对照：荧光曲线呈平坦状，无明显的S形，Ct值较高，表明样本中不含新冠病毒核酸。

微生物学免疫学进展２０１２年第４０卷第１期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｆｅｂ．２０１２，Ｖ０１．４Ｏ，Ｎｏ．１　・４３・　

・综述・　

实时定量ＰＣＲ及其在轮状病毒检测中的应用　

王云瑾　综述；周旭　，余黎　审校　（１．兰州生物制品研究所，兰州７３００４６；２．上海生物制品研究所，上海２０００５２）　

摘要：实时定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ／ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ／ｑＰＣＲ）就是在ＰＣＲ扩增过程中，通过荧光信号对ＰＣＲ进程进行实时监测。它具有特异性强、灵敏度高、定量　准确和快速等优点，在生物医学领域中得到广泛的应用。对实时定量ＰＣＲ技术的原理和类型，实时定量ＰＣＲ技术　在生物医学领域的应用，尤其在轮状病毒诊断、检测及疫苗研究中的应用及其未来前景进行了综述。　关键词：实时定量ＰＣＲ；探针；轮状病毒；应用；综述　中图分类号：Ｒ３７３．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—５６７３（２０１２）０１—００４３—０７　

Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ　

ＷＡＮＧ　Ｙｕｎ－ｊｉｎ，ＺＨＯＵ　Ｘｕ，ＹＵ　Ｌｉ　（Ｊ．Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００４６。Ｃｈｉｎａ；　２．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００５２，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｈａｔ　ｕｓｅｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｆｏｒ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ＰＣＲ．　Ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｆａｓｔ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｗｉｄｅｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄ　ｏｆ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　ｅｎｇｉ—　ｎｅｅｆｉｎｇ．Ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｔｈｅ　ｕｓｅｓ　ｉｎ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｐｒｏｂｅ；Ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ｒｅｖｉｅｗ