荧光定量pcr技术及在动物疫病检测中的应用

安徽农学通报，Ａｎｈｕｉ　Ａｇａ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌ１．２００８，１４（２３）　１６３　

荧光ＰＣＲ技术在动物医学中的应用　

刘　捌　

（南京农业大学动物医学院，江苏南京２１００９５）　

摘要：荧光ＰＣＲ技术是利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术，与普通的ＰＣＲ技术相比．荧光ＰＣＲ　技术具有特异性强、灵敏度高、无污染和快速等优点。近几年，荧光ＰＣＲ技术在动物医学中得到了广泛的应用，　本文着重介绍其在细菌性和病毒性疫病的诊断中所发挥的作用。　关键词：荧光ＰＣＲ；动物疾病；诊断　

中图分类号０６５７　文献标识码Ａ　文章编号１００７—７７３１（２００８）２３—１６３—０２　

荧光ＰＣＲ技术是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基　

团，利用荧光信号积累实时检测整个ＰＣＲ进程，最后通　

过标准曲线对未知模板进行定量的方法。该技术是近年　

发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸的技术　［１］，它具有敏感性高、重复性好、速度快、自动化程度　

高和污染少等优点　，并且可以提高检测效率，缩短检　

测周期，提高经济与社会效益。近年来，荧光ＰＣＲ技术　

应用范围越来越广，特别是在动物医学中的应用得到了　

进一步发展。　

１对细菌病的诊断　

１．１猪链球菌猪链球菌是一种重要的人兽共患病的　

病原菌，主要引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血　

症等疾病，严重危害养猪业的发展。根据猪链球菌的荚　膜多糖抗原（ｃｐｓ）可将其分为３５个血清型，即ｌ一３４　

型和ｌ／２型，其中能引起人和动物发病的血清型主要是　

１型（ＳＳ１）、２型（Ｓｓ２）、７型（Ｓｓ７）和９型（　

ＳＳ９）　。用传统的微生物学病原分离技术结合血清学试　验，能够对猪链球菌进行诊断和血清学分型，但该方法　

费时费力且敏感性不高，易产生非特异性结果。拜廷阳　等　建立了ＳＳ９水解探针（ＴａｑＭａｎ）模式的荧光实时定　

量ＰＣＲ检测方法，与常规ＰＣＲ方法相比，该方法诊断　

更加迅速，整个反应可在１—２　ｈ内完成，且不需要电　

动物医学进展,2005,26(12):97-101ProgressinVeterinaryMedicine

专论与讲座

实时荧光定量PCR技术＊

蒋春燕,王泰健,王　琴＊,范学政

(中国兽医药品监察所,北京100081)

中图分类号:Q503文献标识码:B文章编号:1007-5038(2005)12-0097-05

摘　要:荧光定量PCR技术是一种目前国内

外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始

点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强

度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性

关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因

定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表

达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速

检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。

它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实

现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具

体的试验选择合适的定量方式,从而得到更

准确的试验结果。提高荧光定量PCR技术

的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指

特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2+

浓度、引物和探针浓度、循环数等。

关键词:荧光定量PCR;基因定量;检测技术

随着基因诊断技术的不断发展和成熟,基因诊

断在临床中的地位显得更为重要。自从1983年

Mullis发明聚合酶链式反应(polymerasechainre-

action,PCR)以来,PCR技术作为一种重要的基因

诊断方法,以其迅速、简便、灵敏等优点很快成为科

研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应

用中遇到了一些难题,一是不能准确定量,二是容易

交叉污染,产生假阳性。为克服上述不足,人们采取

了许多方法,如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降

解法等,但均不能得到满意的结果,直到近年来荧光

共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytrans-

fer,FRET)技术用于PCR定量后,上述问题才得到

较好的解决。1992年Higuchi等首次提出了采用动

态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析,为解决传统PCR的难题提出了新的思

128猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2019年36卷第12期养猪一点通EASY SKILL

由于荧光定量PCR（Q-PCR）具有极高的灵敏性[1]，极容易受到污染，所以其对实验室的配置和操作人员的要求更为苛刻。现将Q-PCR在非洲猪瘟检测过程中遇到的常见问题与解决方案和大家分享如下。1 Q-PCR的CT值显示异常Q-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过CT值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。扩增曲线反应了Q-PCR动态进程的曲线；荧光阈值是以前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），一般荧光阈值的默认设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍；CT值是PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，见图1。1.1 阳性对照或阳性样品不显示CT值及解决方案部分检测机构的实验室人员在进行非洲猪瘟样品检测时，时常出摘 要：非洲猪瘟的横空出世，极大促进了荧光定量PCR技术在规模猪场疫病检测实验室中的普及，但荧光定量PCR检测对其操作人员的要求很高。CT值显示异常和实验过程操作不够规范是很多实验室在非洲猪瘟检测中经常遇到的问题，为了得到准确的结果，严格控制实验过程中的污染和掌握实验过程中的操作细节尤为重要。关键词：荧光定量PCR技术；非洲猪瘟检测；问题；方案

基金项目：规模猪场重要疫病防控技术示范推广【编号：NH(19)0408】作者简介：孙华伟（1981- ），男，硕士，助理研究员，执业兽医师，研究方向：猪病的临床诊断及重大疾病流行规律、诊断、监测和控制技术研究。E-mail：sunhuawei66@。*通信作者：张敬峰(1980－)，男，硕士，副研究员，研究方向：畜禽重大疫病流行规律、诊断、监测和控制技术研究。E-mail：343142179@。荧光定量PCR在非洲猪瘟检测中的常见问题与解决方案孙华伟，张敬峰*（江苏省农业科学院兽医诊断检测重点实验室，江苏 南京 210014）

2021年第38卷第3期

107兽用疫苗中BVDV、PCV2和PPV污染三重荧光定量PCR检测方法的建立王　艳1，张秋蕾1，王英华2，俞向前3，张　强1，文德亮3（1. 上海海关，上海　200135；2. 青岛海关，山东青岛　226002；3. 浦东新区动物疫病预防控制中心，上海　201299）摘　要：为建立可以快速同时检测兽用疫苗中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪细小病毒（PPV）3种病原的方法，通过研究比对BVDV 5'-UTR、PCV2 Rep以及PPV NS1基因序列，分别设计合成了3对引物和3条荧光探针，在优化反应条件和反应程序后，建立了一种可同时检测BVDV、PCV2以及PPV的三重荧光定量PCR方法，并对其敏感性、特异性进行了评估。结果显示，建立的三重荧光定量PCR方法灵敏度高，对3种病原核酸的最低检测限均为10 copies/µL；特异性强，与其他相关病原（猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒）均无交叉反应。结果表明，本试验建立的三重荧光定量PCR适于疫苗中外源病毒的检测，可用于疫苗等生物制品质量把控。关键词：牛病毒性腹泻病毒；圆环病毒2型；细小病毒；实时荧光定量PCR；兽用疫苗中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1005-944X（2021）03-0107-05DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.03.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Establishment of a Triple Fluorescent Quantitative PCR for Detecting BVDV，PCV-2 and PPV in Veterinary VaccinesWang Yan1，Zhang Qiulei1，Wang Yinghua2，Yu Xiangqian3，Zhang Qiang1，Wen Deliang3（1. Shanghai Customs，Shanghai　200135，China；2. Qingdao Customs，Qingdao，Shandong　226002，China；3. Pudong New District Center for Animal Disease Prevention Control，Shanghai　201299，China）Abstract：In order to establish a rapid method for simultaneously detecting bovine viral diarrhea virus（BVDV），porcine circovirus type 2（PCV2）and porcine parvovirus（PPV）in veterinary vaccines，three pairs of primers and three fluorescent probes were designed and synthesized through comparing the sequences of BVDV 5'-UTR，PCV2 Rep and PPA NS1 genes，followed by the optimization of reaction conditions and procedures，a triple fluorescent quantitative PCR was established for simultaneously detecting BVDV，PCV2 and PPV，then its sensitivity and specificity were evaluated. The results showed that the established method was with high sensitivity and specificity，its minimum detection limits for the three pathogen nucleic acids were 10 copies/μL，and failed to react with other relevant pathogens，including classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），pseudorabies virus（PRV），African swine fever virus（ASFV）. It was concluded that the method was applicable for detection of exogenous virus in vaccines，and could be used to control the quality of vaccines and other biological products.Key words：BVDV；PCV；PPV；fluorescent quantitative PCR；veterinary vaccine收稿日期：2020-08-17　修回日期：2021-02-07基金项目：上海市科学技术委员会科研计划项目（16DZ0501502