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核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
核酸基因分子探针从化学和生物学的意义上理解，探针是一种已知特异性的分子，它带有合适的标记物供反应后检测。
探针和靶的相互反应如抗原-抗体、血凝素-碳水化合物、亲合素-生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。
用核酸探针与待检标本中核酸杂交，形成杂交体，再用呈色反应显示。
此方法用于疾病的诊断，称为分子杂交基因诊断。
此法开始用于遗传性疾病的诊断如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断。
近来，已发展为诊断外源性病原体如病毒、细菌、原虫等的方法；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；人类基因识别及其生理功能和衰老有关研究；在法医检测中有关性别鉴别和DNA指纹谱的鉴定。
基因探针的研究引起了人们高度重视，在探针的制备技术上有重大突破。
可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。
据美国华尔街分析家预言：“在生物技术市场中，下一个突破和具有吸引力的是基因探针”。
它的巨大的开发潜力和经济效益，已引起人们的重视。
目前基因检测方法中以同位素标记（32P、35S等）DNA探针灵敏度最高，但由于放射性污染、半衰期短、需要特别的安全防护条件等，限制了同位素标记探针的广泛应用。
因此，非同位素标记探针的研制引起重视，自Langer等（1981）合成了生物素化dUTP和NTP类似物以来，开创了用非同位素标记的新领域，用生物素标记核酸探针检测和识别特定的核酸序列，已广泛应用于临床检验和科学研究。
Leary等（1983）用缺口平移法标记的生物素DNA探针成功地用于Southern印迹杂交技术。
Forst等（1985）发表了光敏生物素直接标记核酸的简便方法，使核酸和蛋白质的生物素标记探针技术前进一大步。
Renz等（1984）、Thorpe等（1985）和Pollars 、Knight等（1990）用化学法直接把辣根过氧化物酶接到DNA上，运用发光显影法提高了敏感性。
简述核酸分子探针的分类和标记方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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核酸荧光探针及其分子诊断随着生物技术的不断发展和进步，现代医学研究已经越来越注重从微观角度来研究病因和治疗方法。
而核酸荧光探针及其分子诊断技术作为分子生物学领域的一项核心技术，已经被广泛应用于医学、生物学、化学等领域。
本文将探讨核酸荧光探针的基本原理和应用，以及分子诊断技术的发展和前景。
一、核酸荧光探针的基本原理核酸荧光探针是一种利用荧光技术来检测DNA或RNA的分子探针。
它通常由靶标区域的亲疏水性荧光基团和一个特异的核酸序列构成，在特定条件下通过荧光发射来检测靶标核酸序列。
核酸荧光探针基于荧光探针的原理，即当荧光分子受到光激发后，能量从高能级的激发态转移到低能级的基态时会发射光子。
核酸荧光探针的基本主要有以下三种：1.探针结构上融合有一些特定结构，例如融合环、芳香素等。
2.荧光染料作为基团标识，例如草酸羧基荧光素、罗丹明染料等。
3.与核酸序列配对的荧光标记物。
对于核酸荧光探针，可以根据其所含荧光标记的特异性，分为两种类型：基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)和基于荧光探针的杂交。
这两种方法不同于其他光学检测技术，因为它们不依赖于化学物质反应。
这种无需化学处理的技术是非常强大和灵敏的，因为它可以直接观察到包括DNA 结构突变等的生物反应。
二、核酸荧光探针的应用1、靶向分子的检测核酸荧光探针常用于靶向分子的检测。
例如Covid-19病毒核酸检测，是目前检测Covid-19病毒的主流检测方法之一。
核酸荧光探针能够与Covid-19病毒的核酸相结合，将分子自身和确诊病人样本抗原的能力结合，成为病毒检测的一种主要手段。
2、单细胞定量分析核酸荧光探针可用于单个活细胞的定量分析。
这项技术被广泛应用于癌症细胞免疫治疗、生理学研究等领域。
通过将特定荧光探针标记在细胞上，可以在特定条件下实现单个细胞级别的靶标检测和定量分析。
3、非侵入式实时检测核酸荧光探针可以通过实时荧光放大(Droplet Digital PCR, dPCR)技术进行非侵入性实时检测。
核酸探针技术化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。
抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。
核酸探针技术原理是碱基配对。
互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。
核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。
每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
(一) 核酸探针的种类1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。
作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。
其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。
将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。
cDNA探针适用于RNA病毒的检测。
cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。
将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。
但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。
放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。
放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。
常用的同位素有32P、3H、35S。
其中，以32P应用最普遍。
放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。
核酸探针技术的原理和应用引言核酸探针技术是一种重要的分子生物学工具，通过利用特异性的核酸序列与待测样品中的目标序列进行特异性配对，从而实现对目标序列的检测和定量分析。
本文将介绍核酸探针技术的原理以及其在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用。
一、核酸探针技术的原理核酸探针技术利用两条互补的核酸分子之间的碱基配对原理，通过标记的核酸序列与待测样品中的特定目标序列进行靶向配对。
该技术的原理主要包括以下几个方面：1.互补配对：核酸分子由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们之间可以通过碱基配对形成双链结构。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。
根据这种碱基配对原理，核酸探针可以与目标序列中的特定碱基序列进行互补配对。
2.标记物：核酸探针常常需要进行标记以便于检测。
常用的标记物包括荧光染料、放射性同位素、酶和磁珠等。
标记物的选择取决于具体的实验需求和检测方法。
3.检测方法：核酸探针技术可以通过不同的检测方法进行信号的读取和分析。
常见的检测方法包括荧光检测、放射性测量、酶促反应和磁性检测等。
这些方法可以实现对标记物信号的定量分析和可视化显示。
二、核酸探针技术的应用核酸探针技术具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，被广泛应用于各个领域。
以下是核酸探针技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用：1.基因表达分析：核酸探针技术可用于研究基因的表达模式、调控机制和功能。
通过对目标基因的探针设计和合成，可以检测该基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平。
2.病毒检测：核酸探针技术在病毒检测中具有重要意义。
例如，针对新型冠状病毒（COVID-19）的核酸探针被广泛应用于病毒的快速检测和筛查。
3.癌症诊断：核酸探针技术可用于癌症诊断和预后评估。
通过检测肿瘤标志物的核酸序列，可以快速、准确地判断患者是否患有癌症，以及癌症的类型和分级。
4.药物研发：核酸探针技术在新药研发中发挥重要作用。
核酸探针的名词解释核酸探针是一种生物技术工具，用于检测和定量分析某个特定的核酸序列。
核酸探针广泛应用于生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域，发挥着重要的作用。
本文将对核酸探针进行全面的解释和概述。
首先，核酸探针是由特定的DNA或RNA序列构成的分子探针，可以与目标核酸序列发生亲和作用。
这种亲和作用是通过碱基之间的氢键和静电相互作用来实现的。
当核酸探针与目标序列结合时，可以通过不同的手段进行检测，如荧光、放射性同位素、酶等。
因此，核酸探针可以用于检测及定量分析目标核酸的存在和数量。
核酸探针通常分为两类：探针和探针靶标。
探针是指通过标记物标记的核酸序列，用于寻找、结合和识别特定的目标序列。
标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶等，通过这些标记物的特性，可以将目标序列的存在转化为可见的荧光信号或颜色变化等。
探针的设计需要根据目标序列的特点和要求进行选择，以确保能够高效地与目标序列结合。
而探针靶标是指与探针结合的目标核酸序列。
探针靶标可以是基因、RNA、病毒等，通过与探针的结合，可以准确地检测和定量目标核酸的存在和数量。
探针靶标的选择是基于研究的目的和所需的结果，不同的探针靶标可以提供不同的信息和数据。
核酸探针的优点是具有高度的特异性和灵敏性。
由于核酸探针是专门设计的，可以针对目标序列的独特特点进行选择和设计，使其具有非常高的特异性。
此外，核酸探针的灵敏性也很高，可以检测到非常低浓度的目标分子。
因此，核酸探针常被用于疾病的早期诊断、药物研发、基因工程和环境监测等领域。
然而，核酸探针也存在一些限制和挑战。
首先，核酸探针对目标序列的特异性要求非常高，如果目标序列发生了变异或突变，可能会导致探针无法与其结合，从而导致检测结果的错误。
此外，核酸探针的设计和合成成本相对较高，需要专业的实验室和设备支持。
因此，在使用核酸探针进行研究和应用时，需要充分考虑这些限制和挑战。
目前，核酸探针已经广泛应用于各个领域。
在生命科学研究中，核酸探针常用于基因表达分析、突变检测、病毒感染研究等。
第六章基于分子工程的核酸分子探针生命的本质是一系列可自主调控的化学、物理过程，但主角不是简单的化合物而是复杂的生物大分子。
核酸与蛋白质是生命发生、发展和繁衍中最重要的两类物质，正是它们之间复杂、精巧而协调的相互作用演绎出神奇、千变万化、令人叹为观止的生命现象。
因此，在分子水平上研究核酸、蛋白质等生物大分子及其相互作用是我们深入理解生命现象、揭示生命奥秘最为关键的内容之一。
红细胞:6,000-9, 000nm白细胞:10,000nm一般细菌: 1,000 –10,000 nm 一般病毒:75 –100 nm 蛋白质5 –50 nm DNA (双链宽) 2 nm研究人员需要一些合适的分析工具和手段，在分子水平上，最好是在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用等信息转变为易于检测的光、电信号变化，非常灵敏、准确地反映出来。
以体系的功能为导向，在分子水平上设计所需结构，并定向合成功能分子，是分子工程的重要特征。
通过在分子水平上研究生物分子间的相互作用，设计、合成和筛选具有特定功能的分子探针并发展其生物医学应用，是分子工程的前沿研究领域之一。
核酸分子探针是一种重要的分子生物学研究手段。
它非常巧妙地利用了核酸的结构及其识别能力上的特点，例如核酸的杂交、立体构象转变、与蛋白质、寡聚高分子甚至金属离子的特异性结合等，结合分子水平的信号传导机制，将相关的生命信息转变为易于检测的信号，例如拉曼、荧光、化学发光、电流、放射性等。
随着其他相关学科如化学、材料科学的发展，核酸分子探针的合成、标记和检测技术取得了长足的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为。
与荧光蛋白技术相比，核酸分子探针一般不需要对目标细胞预先进行基因操作，不仅更能反映生命活动的真实状况，而且也便于直接研究临床样品。
分子信标用于果蝇卵母细胞内mRNA 成像PNAS,2003, 100, 13308 核酸适体用于肿瘤细胞的识别PNAS , 2006, 113, 11838核酸分子探针的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为，为细胞信号转导的活体、实时、在线研究提供了条件。
核酸分子探针的发展不仅促进了检测手段的变革，还带来了巨大的经济和社会效益。
•CRE-decoy aptamer 治疗乳腺癌的效果要显著地优于tamoxifen 。
•抗VEGF aptamer (Macugen) 已被用于老年性黄斑变性的临床治疗。
核酸荧光探针TaqMan探针Quench auto-ligation探针蝎形引物探针相邻探针阴阳探针核酶探针核酸适体探针分子信标探针TaqMan探针利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。
探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。
探针的5′端标记有荧光基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，荧光信号很低。
随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，荧光基团远离淬灭基团，即产生荧光信号。
所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。
信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
QUAL(Quench auto－ligation)探针专用于检测RNAs，其荧光信号是化学反应而非构象改变的结果，靶序列存在时表现出简单的开-关信号模式。
由两条探针组成，一条含有一个内在荧光基团和5’端标记的荧光熄灭基团，另一条3’端含有亲核硫逐磷酸酯基团，当两条探针分别与相邻靶序列RNA结合时，亲核硫逐磷酸酯基团取代另一条探针的熄灭基团，并将两条探针连接起来产生荧光信号。
在识别细菌RNAs方面具有显著优势，特别适合检测表达丰度低的RNAs分子。
蝎形引物探针利用了核酸发夹结构，即在引物的非扩增端（5’端）增加一个发夹结构，该发夹结构两端修饰有荧光基团和猝灭基团，环部序列设计得与扩增产物区一段序列相互补。
在没有扩增前，探针部分保持发夹结构，荧光被熄灭；扩增之后，探针的环部序列与产物一段序列互补，因此产生分子内杂交，由于环部序列远长于发夹的茎部序列，因此发夹结构被破坏，发夹两端的荧光基团和猝灭基团被分离而导致荧光恢复。
+Q R Q R R=ReporterQ=Quencher 相邻探针目标DNA/RNA 相邻探针（Adjacent Probes ）相邻探针由两条DNA 组成，分别标记有两个荧光基团，其中一个在3’端标记，另一个在5’端标记。
这两种探针的序列和目标物的序列配对且相邻，这样在靶序列存在时，这两种探针和靶序列进行杂交，使得标记在探针上的两种荧光基团靠近而发生能量转移，通过检测二者荧光强度之比获得能量转移效率，信号强度与目标物的量成正比。
阴阳探针利用了核酸链之间的竞争性杂交实现了对目标链的分析检测。
阴阳探针由两条互补DNA链组成，分别标记有荧光基团和熄灭基团，它们的长度在20到25个碱基左右，其中与目标序列相匹配的一条链比另一条长5个碱基左右。
在没有目标链存在时探针分子的两条链互相杂交，荧光基团与淬灭基团距离很近，荧光被淬灭；当有目标链存在时，与目标序列相匹配的探针链趋向与之杂交，形成更稳定的杂交体，此时荧光基团与淬灭基团分离，荧光不再被淬灭，能检测到较强的荧光信号。
核酶探针核酶（Ribozyme）是一类具有切割特定RNA序列能力的小RNA分子，1981年由Cech等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制时发现，并因此获得1988年诺贝尔化学奖。
由于DNAzyme与底物链发生分子内杂交, 荧光基团与猝灭基团相互靠近, 导致荧光猝灭. 当Pb2+存在时, DNAzyme被激活, 底物链被切断后释放出荧光基团标记的DNA片段, 从而产生明显的荧光信号. 据此可在常温下快速检测Pb2+, 检测下限为10 nmol/L.Target mRNA分子信标Molecular Beaconprotein核酸适体Aptamer分子信标核酸探针分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。
由于它特殊的结构，自从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。
NNN OOO P OO NHOPO O C T A C C C A T C A A A C C T C A C G G G G G G G DABCYL5'3'TAMRA-+O ooc O NH N O O N A A G A 分子信标本身是个呈发夹结构的短链DNA，其环状部分是一个长度在20个碱基左右的和目标分子互补的核酸序列，发夹的两臂是序列互补的5-7个碱基对并在5’端和3’端分别连有荧光基团，一般采用固相合成法获得。
d is ta n ce (n m )2030405060r u p t u r e f o r c e (n N )-1.5-1.0-.50.0.51.0•分子信标与不同目标核酸相互作用的典型力距离曲线实线: MB+target DNA虚线: MB+单碱基突变DNAAFM 研究分子信标与目标核酸的相互作用Y. Jin, K. Wang , W. Tan et al, Anal. Chem., 2004, 76, 5721retractionapproach gold substrate将上述发展的核酸探针按特定基因的序列设计成相应的荧光探针，再利用显微注射的手段将探针注入活细胞内，获取mRNA表达与分布的实时信息。
发展活细胞内mRNA的实时检测方法T 1min 2min 3min4min 6min 9min11min双分子信标用于活细胞内mRNA成像Santangelo PJ, et al. Nucleic Acids Res,2004, 32: e57Target +F QF QMolecularBeaconHybridFluorophore Quencher ÆJ. Perlette and W. H. Tan. Real-time monitoring of intracellular mRNA hybridization inside single living cells.Anal. Chem.73 (22):5544-5550, 2001; T. J. Drake, C. Medley, A. Sen, R. Rogers and Weihong Tan, ChemBioChem, 2005, 5.0 min 3 min 6 min9 min 12 min 15 minBratu等将甲基化修饰的分子信标用显微注射方法引入果蝇卵母细胞中，不仅成功的对活细胞中oskar mRNA的分布进行成像，并且可以实时监测该mRNA在细胞内的转运情况Molecular BeaconOligo ALigatio nHybridABOligo BBindingNTFSNTFS (Nucleotide Fragment Sense )平台技术实时监测核酸的连接过程该平台还被用于核酸磷酸化过程监测，NAD 、ATP 等的高灵敏检测核酸片段检测（NTFS ）平台技术（Nucleic Acid Res., 2003, 31, e148; Nucleic Acid Res., 2005, 33, e97；Analyst,2005,130,350-357; Anal. Biochem., 2006, 353, 141-143; Biomedical Photonics Handbook , 2003, p57-1~57-23, ）Tim e (Second)200400600800F l u o r e s c e n c e I n t e n s i t y1000002000003000004000005000002.30.23 0.115 6.9X10-22.3X10-21.2X10-26.9X10-32.3X10-3400800140000145000150000 2.3X10-31.2X10-32.3X10-4pDNA1DNA2NADNAD检测下限:0.3nM特异性:NADH, NADP, NADPH, dATP, ATP, ADP, AMP该平台还可用于ATP的检测并研究ATP参与的各种生化反应。
例发夹型荧光分子探针用于DNA 甲基化过程的实时监测（Analytical Chemistry , 2007, 79, 1050-1056）Dam Methyalse Concentration (U/ml)0I n i t i a l v e l o c i t yDNA 甲基化过程检测原理Dam 甲基化酶浓度与甲基化速度例DNA 分子机器用于单链DNA 的高灵敏检测(Nucleic Acids Research 2008, revised )primerTargetLong stem MB1234DNA polymeraseTime (S)2004006008001000F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y / a .u160180200220240260280DNA 分子机器的放大效果Time (s)100200300400F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y / a .u50100150200250300c abd e引入放大机制的结果，LOD= 6.4×10-15M 单纯探针与目标杂交的结果，LOD= 1.0×10-10M1×10-10M 6.4×10-15MC DNA1.25×10-8M 1×10-10MC DNA问题与挑战分子信标核酸探针（Molecular Beacons, MB）具有单碱基错配识别能力，但用于活细胞内mRNA监测存在一系列问题，使相关研究受到限制。
