GST融合蛋白纯化方法

Protein Expression Protocol:1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, growovernight;2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight;3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 MIPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice;5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition;6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12%SDS-PAGE;7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice;9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition;10.Prepare the supernatants for purification.蛋白表达注意事项：1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。

GST bestarose 4FF说明书默认分类2010-01-18 09:32:34 阅读257 评论0 字号：大中小GST bestarose 4FF是专门用于纯化pGEX系列载体表达的GST标签蛋白，其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，操作简单，快速。

GST bestarose 4FF 可直接从预处理的细胞裂解物中纯化GST-tagged蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的生物活性。

GST bestarose 4FF 具有高流动性，易于放大，GST bestarose 4FF有快速方便的预装柱，Ez-Fast bestarose 4FF 1ml和5ml。

介质性能谷胱甘肽是通过10碳原子的连接臂偶联到4%高度交联的琼脂糖上。

最优的偶联作用使介质具有高GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽相互作用蛋白的结合能力。

总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合10mg标签蛋白，动态结合能力随着外界因素改变，如不同的目标蛋白，流速等等。

如果需要去除GST部分（天然蛋白分子量为26KD），当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化，选用前种方法，可减少额外分离目的蛋白与GST步骤，消化后，目的蛋白直接用结合液洗脱即可。

表1 GST bestarose 4FF性能配体谷胱甘肽与10碳原子连接臂配体浓度 120-320μmol谷胱甘肽/ml填料蛋白结合能力≈ 10mg重组GST-tagged蛋白/ml填料，GST，Mr26000动态结合能力≈11mgGST-tagged蛋白/ml填料，Mr43000平均颗粒大小90μm组成 4%高度交联的琼脂糖最大流速* 450cm/h（15ml/min），XK层析柱，柱高5cm,水溶性缓冲液，室温纯化建议的流速** 上样：＜100cm/h（＜3ml/min ，XK层析柱）洗涤与洗脱：100-300cm/h（3-10ml/min，XK层析柱）化学稳定性所有常用的水溶性缓冲液中稳定，如：1M醋酸盐，pH7.4，6M 盐酸胍，室温，1hpH稳定性 pH3-12贮存温度 +4-30℃贮存液 20%乙醇* 水是室温的。

蛋⽩纯化和GST沉降技术蛋⽩纯化和GST沉降技术【原理】细菌表达的⾕胱⽢肽s－转移酶（GST）融合蛋⽩主要⽤于蛋⽩的亲和纯化，也可以将GST融合蛋⽩作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋⽩结合，然后根据⾕胱⽢肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋⽩的能⼒来确定相互作⽤的蛋⽩。

⼀般在得到⽬标蛋⽩的抗体前，或发现抗体⼲扰蛋⽩质－蛋⽩质之间的相互作⽤时，可以启⽤GST沉降技术。

该⽅法只是⽤于确定体外的相互作⽤。

【应⽤】1）确定融合（或探针）蛋⽩与未知（或靶）蛋⽩间的新的相互作⽤2）证实探针蛋⽩与已知蛋⽩质间可疑的相互作⽤【⽅法】⼀、GST融合蛋⽩的纯化1、菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，⼀般50ul的冻存菌接⼊5ml的LB中，37℃ 220rpm培养2、活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37℃ 220rpm培养⾄OD≈0.4~0.6 之间，即到达对数⽣长时期（⼤约3~4⼩时）3、取1ml菌液测定OD值，⾄OD≈0.4~0.6 之间，则取诱导前1ml，其余的按1/1000加⼊诱导剂IPTG ，低温⼩量诱导30℃ 200rpm，诱导过夜（⼩于16hr）4、次⽇取诱导后1ml，诱导前和诱导后各1ml，12000rpm ，离⼼2mins，弃上清，加适量的1*PBS,重悬菌液，再加1* loading buffer，混匀，沸⽔煮10mins, 12000rpm ，离⼼2mins，SDS-PAGE电泳考马⽒亮兰染⾊5、如果考染结果显⽰GST融合蛋⽩（GST-X）诱导出来，则做⼤量诱导6、菌种活化后按1%转接种于100ml LB中，30℃ 200rpm 扩⼤培养⾄OD≈0.4~0.6 之间，即到达对数⽣长时期（⼤约3 ⼩时）7、取1ml菌液测定OD值，⾄OD≈0.4~0.6 之间，按1/10000 加⼊诱导剂IPTG ，低温诱导20℃ 180rpm，制冷系数0.5 ，诱导过夜8、次⽇50ml离⼼管收菌, 4℃ 5000rpm 5mins 离⼼，每瓶100ml重复离⼼收于同⼀离⼼管中，⼤型离⼼机提前预冷9、每100ml 菌液沉淀加⼊10ml A 液重悬10、超声破碎。

GST蛋白纯化简介谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种常用的亲和标签，用于在分子生物学研究中用于蛋白质纯化和蛋白质亲和结合实验。

GST蛋白被广泛应用于蛋白质结构和功能研究、酶学研究、蛋白质互作研究等领域。

本文将介绍一种常见的方法来纯化GST蛋白，该方法主要包括以下步骤：细胞裂解、亲和层析、洗脱和纯化。

方法细胞裂解首先需要将GST蛋白表达在适当的宿主中，例如大肠杆菌。

在细胞达到适当的生长阶段后，使用合适的方法将细胞裂解，使得目标蛋白释放到溶液中。

一种常用的裂解方法是超声波裂解，通过超声波震荡将细胞破碎。

亲和层析经过细胞裂解后，将得到的细胞裂解液通过亲和层析柱。

亲和层析柱通常使用含有还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合物质的树脂，例如glutathione agarose beads。

这种树脂与GST标签结合，使得GST标签的融合蛋白能够特异性地结合于柱子上。

通过洗脱液去除非特异结合蛋白，将目标蛋白纯化。

洗脱洗脱过程是将结合于柱子上的目标蛋白从固定相洗净。

一般采用含有高浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液，例如50 mM GSH。

洗脱液中的还原型谷胱甘肽与柱子上的结合物质竞争与GST标签结合，以此达到将GST蛋白洗脱下来。

纯化经过洗脱后，蛋白溶液中的GST蛋白含量较高。

为了进一步提高纯度，可以通过对溶液进行浓缩、去除低分子量杂质、调整溶液pH值等方法进行纯化。

常用的纯化方法包括丙酮沉淀法、离子交换柱层析法等。

注意事项•在实验过程中应严格操作，避免任何可能导致目标蛋白污染的情况发生。

•选择合适的表达宿主，不同的宿主可能会对GST蛋白的表达量和可溶性产生影响。

•在细胞裂解过程中，避免样品受到温度、剧烈振荡等因素的影响。

•注意亲和层析柱的操作方法，避免破损或污染。

•洗脱过程中注意还原型谷胱甘肽浓度和洗脱液的pH 值。

结论GST蛋白纯化是一种常见的蛋白质纯化方法，通过亲和层析技术可以实现对GST蛋白的高效纯化。

gst融合蛋白的分离和纯化的原理
第一步，细胞裂解。

通常使用化学方法、物理方法或超声波等手段将目标蛋白所在的表达系统的细胞破碎，使蛋白从细胞溶液提取出来。

常用的细胞裂解方法有冻融法、超声波法和高压法等。

第二步，亲和层析。

利用GST融合蛋白在蛋白A/G琼脂糖或S-蛋白琼脂糖柱上与谷胱甘肽硫转移酶（GST）结合的特性，将目标蛋白与其他非特异性蛋白分离。

在这一步骤中，首先需要将裂解液与亲和层析树脂（例如：GST树脂）充分混合，使GST融合蛋白与亲和树脂结合；然后通过洗涤步骤，去除非特异性蛋白质的结合；最后，目标蛋白与亲和树脂的结合被破坏，并将其洗脱出来。

第三步，洗脱。

通过改变亲和层析树脂的pH值、离子浓度或添加特定试剂，破坏GST融合蛋白与亲和树脂的结合，实现目标蛋白从树脂上的洗脱。

常用的洗脱方法有酸洗脱、碱洗脱和还原洗脱。

第四步，纯化。

将洗脱的目标蛋白进行进一步的分离和纯化。

通常，还需要使用其他纯化方法，例如离心、电泳、层析等，进一步净化目标蛋白。

总的来说，GST融合蛋白的分离和纯化的原理是通过利用GST融合蛋白与亲和树脂之间的特异性结合，将目标蛋白与非特异性蛋白分离，然后通过改变条件破坏结合并将目标蛋白洗脱，最后进行进一步的纯化步骤，得到纯化后的目标蛋白。

这种方法具有简单、快速、高效的优点，在蛋白质分离和纯化的研究中得到广泛应用。

SOP6 谷胱甘肽亲和柱纯化带谷胱甘肽还原酶（GST)标签蛋白1.样品制备与“SOP Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白”中样品制备方法相同，裂解缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，0.5mM DTT ，1mM PMSF，1mM NaF ，protease inhibitors cocktail，pH7.5) 。

（PMSF，DTT，protease inhibitors cocktail在破菌前加入。

）适合于GST Pull- Down的细菌裂解液配方还有很多。

2.样品纯化Glutathione Beads亲和树脂灌装层析柱或直接使用Glutathione Beads预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。

2.1 平衡层析柱至工作温度，纯化过程可在室温或4℃进行。

2.2 将层析柱固定在支架上，让其流尽树脂保护液，快流干的时候用至少5倍体积的平衡/洗涤缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)冲洗柱子。

2.3 制备的蛋白样品与平衡/洗涤缓冲液1:1混合，加到平衡好的Glutathione Beads中（保证目的蛋白与Glutathione Beads充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流穿液。

2.4 用10～15倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液清洗柱床，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗涤液。

2.5 使用5～10倍柱床体积的洗脱缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0），收集洗脱液，即目的蛋白组分。

还原型Glutathione易氧化，也容易影响pH,需现用现配,同时注意调pH 8.0。

3.SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。

GST融合蛋白纯化方法
1) 1 目的片段接入pGEX载体；
2) 2 涂板，挑单克隆，2ml培养基小摇过夜
3）将小摇菌液接种至大摇培养基，37℃进行扩增，摇菌至OD600≈0.6-1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）25℃诱导2-3 h（或者低温诱导过夜）；
4）离心收菌（8000rpm,10 min），弃培养基，清洗细菌（用PBS离心），每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1:3000β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）,溶菌酶（母液10mg/ml,终浓度0.5mg/ml），冰上30min,或-20℃过夜；
以下步骤均在冰上操作：
5）超声破碎菌体(3个99个循环，工作3s，间隙3s)，加TritonX-100至终浓度为0.5%，在4℃翻转器上摇30min以充分混匀，固定融合蛋白。

6） 12000 rpm,4℃，30min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads(使用前用PBS清洗2-3次)，在4℃翻转器上孵育4-5h；
7） 3000 rpm，5min离心弃上清,用PBS清洗3次（10ml PBS摇10min,离心5min）,上柱（柱子使用前清洗干净，并用PBS润洗）；
8）加入0.5 mL GST Elution Buffer，轻摇，2000 rmp，1 min离心，收集上清；
9）重复步骤8）至少两次；
10） SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度；
11）将蛋白置于-80℃保存。

GST Elution Buffer:10mM Glutathione,50mM Tris-Cl, pH 8.0, 1;1000 加入PI
大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条件。

gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。

其鉴定蛋白纯化结果的原理如下：
- 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合；
- 融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合；
- 将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间；
- 洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。

通过观察电泳结果，可以分析出蛋白间的互作关系，从而鉴定蛋白纯化结果。