GST标签蛋白纯化的GSH磁珠
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GST标签的蛋白纯化
GST标签的蛋白纯化1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬，置于冰上超声10min（超声5s，停10s）。
2.超声所得产物留样1mL，剩余样品4℃，12000rpm离心30min。
3.收集上清，用0.45um的过滤器过滤，留样1mL 。
沉淀用20mL 1×PBS 重悬，留样1mL。
沉淀于-30℃保存。
4.准备Binding Buffer 1×PBS，pH=7.3Elution Buffer 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH=8.0分别加入1mM DTT用于洗脱和结合8.使用蠕动泵将Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速平衡柱。
避免空气进入柱内。
9.使用蠕动泵将样品注入柱中，以1mL/min的流速结合样品，循环上样3次。
10.使用蠕动泵将50mL Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速清洗柱。
11.使用蠕动泵将20mL Elution Buffer注入柱中，以1mL/min的流速结合蛋白。
从第2mL开始，每1mL 产物收集在1.3mL EP管中。
共收集10柱体积的产物。
剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。
12.使用蠕动泵将50mL 超纯水注入柱中，以2mL/min的流速1清洗柱。
13.使用蠕动泵将20mL 20%酒精注入柱中，以2mL/min的流速，当柱中充满酒精时将柱取下保存在4℃。
14.将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min，12000rpm离心10min，吸取上清。
同蛋白产物一同进行SDS-PAGE电泳。
根据电泳结果，推测GST标签蛋白可能以包涵体形式存在于沉淀中接菌pw61，进行小量诱导，并制备蛋白样品根据电泳结果显示，推测GST标签蛋白存在于沉淀中。
Western Blot 未显示有条带，丽春红染色有明显条带，推测使用的GST抗体不能与目的条带特异性结合。
纯化可溶性蛋白3875裂解：将离心好的菌沉淀取出，500 ml菌液用60 ml Buffer A平衡缓冲液将沉淀重悬。
蛋白质表达：带GST标签蛋白的纯化
细胞抽提物的制备
操作前的考虑
• BugBuster蛋白抽提试剂，以及Benzonase®核酸酶、rLysozyme™溶菌酶等能极大地方便可溶蛋白 及包涵体的制备，从而完全替代机械法操作，尽可能地保全蛋白。
• BugBuster，Benzonase核酸酶，rLysozyme溶菌酶及GST•Bind系统均可与蛋白酶抑制剂兼容。 • GST•Bind纯化系统可以与2-巯基乙醇，二硫苏糖醇以及EDTA等兼容。 • 本手册中的操作均可按实际表达水平和目的蛋白的量适当加以调整，特别是关于“柱层析”部分中的
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@merc这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上 样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液 在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步 分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋 白经冻融会失活。
储存
要求4℃存放的包括：10X GST Bind/Wash Buffer；10X Glutathione Reconstitution Buffer； Glutathione，Reduced，Free Acid；GST•Bind树脂（树脂千万不能冻） 要求-20℃存放的包括：Benzonase核酸酶 常温存放的包括：BugBuster，色谱柱
GST•Bind™ 缓冲液试剂盒
GST•Bind缓冲液试剂盒包括了从GST•Bind树脂和GST•Mag™磁性琼脂糖树脂纯化目的蛋白所需的结 合，冲洗和洗脱所需的缓冲液。试剂盒所含成分足够用于10个2.5ml柱的纯化。具体包括： • 2×100ml 10×GST Bind/Wash Buffer （43mM Na2HPO4，14.7mM KH2PO4，1.37M NaCl，27mM KCl，pH7.3） • 40ml 10×Glutathione Reconstitution Buffer (500mM Tris-HCl，pH8.0) • 1g Glutathione，Reduced，Free Acid
操作前的考虑
• BugBuster蛋白抽提试剂，以及Benzonase®核酸酶、rLysozyme™溶菌酶等能极大地方便可溶蛋白 及包涵体的制备，从而完全替代机械法操作，尽可能地保全蛋白。
• BugBuster，Benzonase核酸酶，rLysozyme溶菌酶及GST•Bind系统均可与蛋白酶抑制剂兼容。 • GST•Bind纯化系统可以与2-巯基乙醇，二硫苏糖醇以及EDTA等兼容。 • 本手册中的操作均可按实际表达水平和目的蛋白的量适当加以调整，特别是关于“柱层析”部分中的
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@merc这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上 样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液 在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步 分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋 白经冻融会失活。
储存
要求4℃存放的包括：10X GST Bind/Wash Buffer；10X Glutathione Reconstitution Buffer； Glutathione，Reduced，Free Acid；GST•Bind树脂（树脂千万不能冻） 要求-20℃存放的包括：Benzonase核酸酶 常温存放的包括：BugBuster，色谱柱
GST•Bind™ 缓冲液试剂盒
GST•Bind缓冲液试剂盒包括了从GST•Bind树脂和GST•Mag™磁性琼脂糖树脂纯化目的蛋白所需的结 合，冲洗和洗脱所需的缓冲液。试剂盒所含成分足够用于10个2.5ml柱的纯化。具体包括： • 2×100ml 10×GST Bind/Wash Buffer （43mM Na2HPO4，14.7mM KH2PO4，1.37M NaCl，27mM KCl，pH7.3） • 40ml 10×Glutathione Reconstitution Buffer (500mM Tris-HCl，pH8.0) • 1g Glutathione，Reduced，Free Acid
GST融合蛋白表达与纯化
200g/L的三氯醋酸（TCA；用0.22μm的滤器除菌，4℃保存≤1个月）
70%（V/V）乙醇
适于水溶液的0.22μm膜
1、在1.5ml的微量离心管中放入1ml表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物，4℃，最高转速离心2min，收集上清，将其过0.22μm的膜，收入1.5ml的微量离心管中，弃沉淀。
材料（带√的项见附录1）
用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株
√M9最低营养培养基加0.5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）
√1000x抗生素贮液
√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）
20ml无菌培养管
150ml摇瓶
37℃定轨摇床
1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。
转化的大肠杆菌宿主菌株
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
√20%（V/V）甘油，无菌的
√LB平板
20ml培养管
30℃或37℃定轨摇床
1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落，接种2ml LB培养基（补加适当的抗生素；在20ml培养管中），在定轨摇床上培养过夜。对于基于pL的系统，温度为30℃，对于其他系统，温度为37℃。
辅助方案5 细胞外培养基样品的制备
通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。如果培养物中蛋白质浓度很低（如低于100mg/L），可以加入牛血清白蛋白（BSA）作为沉淀的载体和核。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
2g/L BSA（可选；用0.22μm的膜除菌，4℃保存≤1个月）
70%（V/V）乙醇
适于水溶液的0.22μm膜
1、在1.5ml的微量离心管中放入1ml表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物，4℃，最高转速离心2min，收集上清，将其过0.22μm的膜，收入1.5ml的微量离心管中，弃沉淀。
材料（带√的项见附录1）
用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株
√M9最低营养培养基加0.5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）
√1000x抗生素贮液
√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）
20ml无菌培养管
150ml摇瓶
37℃定轨摇床
1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。
转化的大肠杆菌宿主菌株
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
√20%（V/V）甘油，无菌的
√LB平板
20ml培养管
30℃或37℃定轨摇床
1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落，接种2ml LB培养基（补加适当的抗生素；在20ml培养管中），在定轨摇床上培养过夜。对于基于pL的系统，温度为30℃，对于其他系统，温度为37℃。
辅助方案5 细胞外培养基样品的制备
通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。如果培养物中蛋白质浓度很低（如低于100mg/L），可以加入牛血清白蛋白（BSA）作为沉淀的载体和核。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
2g/L BSA（可选；用0.22μm的膜除菌，4℃保存≤1个月）
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B（GST 标签纯化树脂）说明书
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B （GST 标签纯化树脂）说明书货号：P2020规格：5mL/10mL/25mL/50mL保存：4℃保存，有效期至少一年。
产品简介：pGEX 载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。
GSTs 是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。
由于GST 对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合蛋白的纯化效率很高。
可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST 融合蛋白。
树脂用3mol/L NaCl 的缓冲液再生。
谷胱甘肽琼脂糖对GST 融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。
特性:粒度：45-165µm流速：75cm/h 工作PH ：4-10耐压：0.3Mpa载量：＞5mg 谷胱甘肽S-转移酶使用说明：谷胱甘肽树脂的处理:1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2.取部分匀浆放入15mL 聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。
3.4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS ，颠倒数次混匀，4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS ，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物：6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS 缓冲液中。
7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。
8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入DNase 和RNase 至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g 离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度1mmol/L 。
纯泰GST(GSH)亲和层析介质使用说明书
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽 洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表 达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重 新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点 的情况下，更换通用载体。 5. 如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘 肽，可采用超滤或透析的方法。
七、GST标签切除 GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或
邮编：201203
电邮：order@
电话：021-50797319 传真：021-50797322
网址：
-3-
包装规格 5ml 25ml 100ml
>200ml 2×1ml 1×5ml
说明 6% 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 ， 动 态 载 量 约 15mg/ml，享受配套购买缓冲试剂、层 析柱 8 折优惠
单次购买量 含 2 根 1ml 重力预装柱 含 1 根 5ml 重力预装柱
市场价 1100 5200 18000
邮编：201203
电邮：order@
电话：021-50797319 传真：021-50797322
网址：
μm 滤膜过滤备用。 2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml 平衡缓冲液的比例充 分悬浮离心收集的菌体；600w 功率，每循环超声 3s，冷却 3s，循环 99×3 次,破碎菌体；4℃、15000rpm 离心 15m，收集上清液，或用 0.45μm 滤膜过滤。
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％ Tween-20等稳定剂。 2) GST融合蛋白不完全表达
GST 融 合 蛋 白 有 时 候 只 表 达 到 GST 部 分 就 终 止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与 介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD 左右的杂带。
七、GST标签切除 GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或
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包装规格 5ml 25ml 100ml
>200ml 2×1ml 1×5ml
说明 6% 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 ， 动 态 载 量 约 15mg/ml，享受配套购买缓冲试剂、层 析柱 8 折优惠
单次购买量 含 2 根 1ml 重力预装柱 含 1 根 5ml 重力预装柱
市场价 1100 5200 18000
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电话：021-50797319 传真：021-50797322
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μm 滤膜过滤备用。 2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml 平衡缓冲液的比例充 分悬浮离心收集的菌体；600w 功率，每循环超声 3s，冷却 3s，循环 99×3 次,破碎菌体；4℃、15000rpm 离心 15m，收集上清液，或用 0.45μm 滤膜过滤。
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％ Tween-20等稳定剂。 2) GST融合蛋白不完全表达
GST 融 合 蛋 白 有 时 候 只 表 达 到 GST 部 分 就 终 止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与 介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD 左右的杂带。
flag磁珠说明书
flag磁珠说明书Anti-Flag磁珠，也称Anti-Flag免疫磁珠或Flag抗体磁珠，是由高品质的Flag 小鼠单克隆抗体与纳米级氨基磁珠共价偶联而成，可特异性地与动植物或微生物裂解液、血清、腹水等中含有Flag标签的蛋白结合，从而用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)、免疫共沉淀(Co-IP)或纯化。
Flag标签(Flag-tag)、Myc标签(Myc-tag)、HA标签(HA-tag)、His标签(His-tag)和GST标签(GST-tag)等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。
Flag-tag是8个氨基酸残基(DYKDDDDK)组成的多肽，常用的形式有Flag和3X Flag，通过基因重组技术把Flag-tag的核酸序列与目的基因的5’端或3’端连接，就可以最终表达形成Flag-tag的目的蛋白。
Flag-tag具有以下优点：Flag-tag通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；Flag-tag作为标签蛋白，后续通过Flag抗体(AF519)、Anti-Flag磁珠或Anti-Flag亲和凝胶(P2271)即可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag标签，可被肠激酶(Enterokinase, EK)切除(DDDK)，从而得到完美的没有标签的目的蛋白。
基于以上优点，Flag标签已被广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、相互作用和功能等多方面的研究。
Anti-Flag Magnetic Beads (Anti-Flag磁珠)，也被称为Anti-DYKDDDDK Magnetic Beads，可以特异性地结合Flag标签融合蛋白，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀或纯化等实验。
GST蛋白纯化
三．GST融合蛋白纯化（1）GST亲和纯化1．介质保存：20％乙醇2．所需试剂：①10×PBS（1L）：pH7.4 (4℃)150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g)②10×洗脱前buffer（100ml）：pH8.0 (25℃)50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g)③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)：pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.050mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g)洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。
8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽）④3M NaCl3．纯化步骤及注意事项：①PBS平衡柱子：至少5个柱体积②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力）③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。
④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可（2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例）先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。
鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。
合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。
寡核苷酸磁珠制备_概述及解释说明
寡核苷酸磁珠制备概述及解释说明1. 引言1.1 概述寡核苷酸磁珠是一种新型的功能性材料，它具有在生物科学和医学领域中广泛应用的潜力。
寡核苷酸磁珠通过将寡核苷酸与磁性珠子结合而成，可用于DNA/RNA的分离、寡核苷酸的捕获和纯化等实验操作。
相比传统的分离方法，如柱层析法和凝胶电泳法，寡核苷酸磁珠具有操作简便、高度纯化和高效快速等特点。
因此，了解寡核苷酸磁珠的制备过程、性能评价与优化方法对于开展相关研究具有重要意义。
1.2 文章结构本文分为五个主要部分：引言、寡核苷酸磁珠制备、寡核苷酸磁珠制备过程详解、寡核苷酸磁珠的性能评价与优化以及结论与展望。
1.3 目的本文旨在介绍和解释寡核苷酸磁珠的制备方法及其应用领域，并详细解析寡核苷酸磁珠制备的过程、性能评价与优化方法。
对于那些对寡核苷酸磁珠感兴趣或希望开展相关研究的科学家和研究人员，本文将提供一份全面且详尽的概述，以期为他们在实验室中使用寡核苷酸磁珠提供指导和帮助。
2. 寡核苷酸磁珠制备2.1 什么是寡核苷酸磁珠寡核苷酸磁珠是一种含有单链或双链寡核苷酸的磁性微球。
寡核苷酸是由较短的核苷酸片段组成，通常包含20到100个碱基对。
这些磁性微球通过在表面修饰具有亲和力的功能分子，能够高效地与目标物质相结合，实现其分离、富集和纯化等应用。
2.2 制备方法寡核苷酸磁珠的制备主要包括以下几个步骤：1. 合成聚合物：首先，在水溶液中合成一个聚合物作为载体材料，并赋予其一定的磁性。
这一步通常可以通过共沉淀法、共加缩聚剂法或胶体溶胶法等方法来实现。
2. 寡核苷酸修饰：将所需的寡核苷酸分子与载体材料表面进行化学修饰，使其与载体材料发生共价结合或非共价结合，从而将寡核苷酸引入到磁性微球的表面。
3. 粒径调控：通过对反应体系中不同组分和条件的调整，可以控制寡核苷酸磁珠的粒径大小。
具体方法包括添加乳化剂、调节溶剂和反应温度等因素。
4. 反应洗脱：对合成后的磁珠进行洗脱步骤，以去除未结合的寡核苷酸和其他杂质物质。
蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析
蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析蛋白纯化试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。
蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签、HIS 标签等，本文主要介绍了蛋白纯化试剂盒的原理、His Tag 蛋白纯化方法试剂选择的方法、GST 标签融合蛋白纯化问题分析等。
蛋白抽提试剂盒和蛋白纯化试剂盒用途有什么不同?蛋白抽提试剂盒是从细菌、真菌、新鲜动植物组织或细胞蛋白、培养动植物组织将全细胞蛋白、核蛋白、胞浆蛋白、带化学修饰基团的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一种或两种以上作为目标从样品中分离收集的一套试剂。
用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等目的。
蛋白纯化试剂盒用于将连接有Flag标签GST HIS 标签的重组蛋白、包涵体蛋白、抗体从重组蛋白表达系统中高效浓缩分离出来。
主要原理是利用蛋白A或蛋白G与抗体的不变区有多个结合位点或Ni- Sepharose与HIS标签蛋白在不同缓冲液条件下亲和能力多得多差异分离目标蛋白。
将蛋白A与Sepharose共价交联制备的层析介质，可以用于纯化抗体。
抗体与蛋白A或蛋白G在高盐高pH值条件下结合，在低盐低pH值条件下解离。
蛋白纯化试剂盒广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。
GST常见问题解答集锦纯化方法的问题解决以下解决问题的指南指出了对于大多数纯化方法的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有提及,这种情况下会指出相应的纯化方法.问题可能原因解决方法G S T 标签蛋白GST标签蛋白被机械裂解的方法在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件.裂解的条件不结合柱子或变性(比如超声).过分的裂解必须依照经验来决定. 结合非常弱会使标签蛋白变性,阻止其结合. GST标签蛋白在样品中有聚集, 在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT.1-20mM 导致沉淀标签蛋白的浓度过低的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合. 浓缩样品.结合能力是浓度依赖的.低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子.因此,浓缩样品会提高结合. 标签蛋白可能改变了G S T 的构检测所使用的pGEX载体中GST的结合.准备带有所使用的象,因此降低了GST标签蛋白的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合.如果结合结合能力. 的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的亲和力.可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果. 平衡时间太短确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如PBS). GST标签蛋白在pH值低于6.5和高在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如于8时结合效率低GSTrap柱:柱子需要清洗PBS). 根据标准的清洗步骤清洗柱子(见附录2).如果GSTrap柱已经用过几次了,可能需要换用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗过程请见附录次数过多样品上样过程中的流速过高2) 降低在上样时的流速.影响GST标签蛋白结合的一个重要参数就是流速.由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或柱:柱子或系统被堵住了,导致用0.45m的滤膜过滤过了. 高压力和无结合. 系统堵住了:将柱子换成一段管子.如果压力高于0.3MPa,根据手册清洗系统在KTAprime plus上的GSTrap 检测是否使用了正确的柱子. 柱:样品不结合检测流入管是否接入了正确的流入端口. 检测缓冲液的组成和pH值是否正确.检测样品是否已经被调节到适合结合缓冲液的条件.1G S T 标签蛋白洗脱缓冲液的体积不够不能被高效的洗脱洗脱的时间不够增加洗脱缓冲液的体积.有些情况下,尤其是柱上酶切有标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白. 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间. 对于GSTrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流速(5ml HiTrap柱).对于离心方法,降低洗脱过程中的离心速度.谷胱甘肽的浓度不够增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外.尝试使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作为洗脱缓冲液.洗脱缓冲液的pH过低增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度.洗脱缓冲液的离子强度过低.增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.10.2M的氯化钠也会使结果变好.洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化使用新鲜的洗脱缓冲液. 了加入DTT.非特异的疏水相互作用导致蛋白向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂.加入1%的TritonX-100 和柱材非特异的结合或聚集,从或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的而阻止了标签蛋白的溶解和洗洗脱. 脱. 电泳或蛋白质分子量为70 000 的蛋白与GST标分子量为70 000 的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物. 免疫印迹检测签蛋白共纯化发现多条条带该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠.有报道这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C温浴10分钟而破坏.或者把有标签蛋白通过A TP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层析来除去. 标签蛋白被蛋白酶部分降解加入蛋白酶抑制剂.多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会使结果变好.一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC.注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶.经GE Healthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的话使用Pefabloc SC.2在宿主细菌中的蛋白降解用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的.如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT).大肠杆菌BL21随pGEX载体提供. 这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株.在机械裂解过程中细胞破碎降低裂解时间:细胞裂解表面上是使悬浊液部分澄清,可以通过镜检检测.机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好.避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性.过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯化.分子伴侣可能被共纯化了包括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成.这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠.这些包括,但不仅仅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些从这些共纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表.抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源. 反应它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠杆菌蛋白能够反应.通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来除掉那些能够交叉反应的抗体.GE Healthcare的GST抗体已经和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白质免疫印迹中没有非特异条带. 目的蛋白酶切蛋白酶切发生在宿主细菌内后电泳检测发现多条条带检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.这些条带可能是在宿主细菌中降解的结果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,检查序列.细节请参见《GST基因融合系统手册》.His Tag 蛋白纯化方法之选择全攻略HisTag 蛋白纯化篇：用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的。
多肽标签在重组蛋白纯化和检测中的应用
His标签His标签是一种由六个组氨酸残基组成的融合标签，可以插入在目的蛋白的N端或C端。
His标签的优点是可以利用组氨酸残基与金属离子的亲和力，通过固定化金属螯合亲和层析（IMAC）实现对重组蛋白的高效纯化。
His标签的分子量小，一般不影响目的蛋白的功能和结构，而且可以在非变性或变性条件下进行纯化。
His标签也可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究，以及抗体制备。
•His标签的结构：His标签由六个组氨酸残基组成，其氨基酸序列为HHHHHH，其分子量约为0.84 kDa。
His标签可以与镍、钴、铜等金属离子形成配位键，从而实现亲和层析。
•His标签的纯化方法：His标签蛋白的纯化方法主要有两种，一种是通过含有金属离子的琼脂糖凝胶柱进行纯化，另一种是通过含有金属离子的磁珠进行纯化。
两种方法都需要用含有金属离子的缓冲液进行平衡和洗涤，用含有高浓度亲和配体（如咪唑）或低pH值的缓冲液进行洗脱。
•His标签的应用范围：His标签蛋白可以用于各种生物学研究，例如：o蛋白质-蛋白质相互作用：可以利用His标签与金属离子之间的亲和力，将目的蛋白固定在金属离子表面，然后与其他蛋白质进行结合实验，例如ELISA、Western blot、免疫沉淀等。
o蛋白质-DNA相互作用：可以利用His标签与金属离子之间的亲和力，将目的蛋白固定在金属离子表面，然后与DNA进行结合实验，例如EMSA、DNase I footprinting、ChIP等。
o抗体制备：可以利用His标签作为抗原刺激动物产生抗体，或者利用抗His抗体作为二抗进行检测。
Flag标签Flag标签是一种由八个氨基酸（DYKDDDDK）组成的亲水性多肽，可以融合在目的蛋白的N端或C端。
Flag标签的优点是可以利用其高度特异性和亲和力，通过抗Flag抗体进行重组蛋白的纯化和检测。
Flag标签通常不会与目的蛋白相互作用，也不会影响目的蛋白的功能和性质。
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3. 磁珠预处理
一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信 息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液 收获1g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为5～10mg， 则需要取10 mL 10%(v/v)的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化，以下即以 此为例进行详细说明。
7. After treatment of magnetic beads 1 Binding buffer
2 Washing buffer
8. Regeneration of magnetic beads 3 Elution buffer
目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各 种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此， 在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合目 标蛋白的缓冲液，包括结合缓冲液(Buffer A)和洗脱缓冲液(Buffer B)。 以下提供一个较强结合力的GST标签蛋白的纯化流程，以供参考。
储存方法
保存于20%乙醇中，2-8℃保质期一年。切勿冻存。
实验方法
1. Buffer Preparation
1. 缓冲溶液配制
A. Binding Buffer: 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
B. Elution Buffer: 50 mM Tris- HCl, 10 mM GSH, pH 8.0.
注： (1). 还原型谷胱甘肽容易氧化，Elution Buffer要求现配现用； (2). 不同的GST融合蛋白与磁珠结合的强弱程度不同，对大部分的 GST融合蛋白，使用含有10 mM还原性谷胱甘肽的Elution Buffer即 可洗脱目标蛋白。对少数结合能力较强的GST融合蛋白，可以适当延 长洗脱时间，增加洗涤次数，或提高Elution Buffer中还原型谷胱甘 肽的浓度。 (3). Binding Buffer和Elution Buffer中可以添加1~5mM EDTA， 1~10mM DTT，0.1~1% Triton X-100，0.1~1% Tween 20等，以 提高目标蛋白的稳定性。
2. 样品处理 本手册提供以下三种样品的处理方法：
A. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；冰浴 超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在 粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30min，以降解核酸。另外， 如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。 B. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释平衡， 即为粗蛋白样品。 C. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次， 弃上清；用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v) NP-40的Binding Buffer重悬；加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；置于冰 上10min，即为粗蛋白样品。
lysis 1
+
2. Sample Preparation 3. Magnetic beads pretreatment 4. Protein Binding
2 5. Washing
3 6. Elution
Cells/bacterium Target protein Other proteins Magnetic Beads Magnetic Separator Collect Supernatant Pipette Repeat
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(1). 将产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取10 mL磁珠悬液 于离心管中。 (2). 将离心管置于磁性分离器上，待溶液变澄清后，移去上清液。 (3). 加入5~10 mL Binding Buffer到上述装有磁珠的离心管中，盖紧 盖子，漩涡振荡15s，使磁珠重新悬浮；将离心管置于磁性分离器上， 磁性分离*，移去上清液。 (4). 重复步骤(3)2次。
情况1：重复使用次数较少，结合能力下降不明显时，可以采用高pH 和低pH buffer交替洗涤的方式进行清洗。 (1). 使用后的磁珠加入10 mL Buffer C（0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl， pH8.5），漩涡振荡60s，磁性分离，去除上清液； (2). 加入10 mL Buffer D（0.1M Sodium Acetate，0.5M NaCl， pH4.5），漩涡振荡60s，磁性分离，去除上清液； (3). 重复步骤(1)和(2)2次。
Preparation Method: Add 0.307g GSH to 100 mL 0.1 M Tris- HCl, then adjust pH to 8.0 with 0.1 M HCl and add deionized water to a total volume of 100 mL.
GST标签蛋白纯化的GSH磁珠
产品组分
产品组分 B23701
B23702Байду номын сангаас
B23703
B23704
体积
5 mL
5 mL x 2
5 mL x 2 5 mL x 5
磁珠粒径
50-100 μm
产品参数
浓度 GSH配基含量
10%(v/v)磁珠悬液 20-30 μmol/mL
GST融合蛋白结合量（参考值） 5-10 mg/ml纯磁珠
（注*：操作过程中，如离心管盖上粘有磁珠，为避免损失，可将离 心管置于磁性分离器上，盖紧离心管盖，待溶液变澄清后，手持磁性 分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的 磁珠；静置片刻，使溶液重新变澄清，以下同。）
4. 目标蛋白与磁珠结合 (1). 用10 mL Binding Buffer悬浮1g湿重的菌体，进行破碎和裂解后， 即为粗蛋白样品。 (2). 将粗蛋白样品加入到装有预处理磁珠的离心管中，盖紧离心管盖。 (3). 将离心管置于漩涡混匀器振荡15s，然后置于旋转混合仪上，室温 旋转混合20～30min（如果需要，可在4～8℃的低温环境下旋转混合 约1h，防止目标蛋白降解）。 (4). 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离 心管中以备后续检测。从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。