GST蛋白纯化步骤

GST标签的蛋白纯化1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬，置于冰上超声10min（超声5s，停10s）。

2.超声所得产物留样1mL，剩余样品4℃，12000rpm离心30min。

3.收集上清，用0.45um的过滤器过滤，留样1mL 。

沉淀用20mL 1×PBS 重悬，留样1mL。

沉淀于-30℃保存。

4.准备Binding Buffer 1×PBS，pH=7.3Elution Buffer 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH=8.0分别加入1mM DTT用于洗脱和结合8.使用蠕动泵将Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速平衡柱。

避免空气进入柱内。

9.使用蠕动泵将样品注入柱中，以1mL/min的流速结合样品，循环上样3次。

10.使用蠕动泵将50mL Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速清洗柱。

11.使用蠕动泵将20mL Elution Buffer注入柱中，以1mL/min的流速结合蛋白。

从第2mL开始，每1mL 产物收集在1.3mL EP管中。

共收集10柱体积的产物。

剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。

12.使用蠕动泵将50mL 超纯水注入柱中，以2mL/min的流速1清洗柱。

13.使用蠕动泵将20mL 20%酒精注入柱中，以2mL/min的流速，当柱中充满酒精时将柱取下保存在4℃。

14.将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min，12000rpm离心10min，吸取上清。

同蛋白产物一同进行SDS-PAGE电泳。

根据电泳结果，推测GST标签蛋白可能以包涵体形式存在于沉淀中接菌pw61，进行小量诱导，并制备蛋白样品根据电泳结果显示，推测GST标签蛋白存在于沉淀中。

Western Blot 未显示有条带，丽春红染色有明显条带，推测使用的GST抗体不能与目的条带特异性结合。

纯化可溶性蛋白3875裂解：将离心好的菌沉淀取出，500 ml菌液用60 ml Buffer A平衡缓冲液将沉淀重悬。

Protein Expression Protocol:1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, growovernight;2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight;3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 MIPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice;5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition;6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12%SDS-PAGE;7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice;9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition;10.Prepare the supernatants for purification.蛋白表达注意事项：1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。

GST蛋白纯化简介谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种常用的亲和标签，用于在分子生物学研究中用于蛋白质纯化和蛋白质亲和结合实验。

GST蛋白被广泛应用于蛋白质结构和功能研究、酶学研究、蛋白质互作研究等领域。

本文将介绍一种常见的方法来纯化GST蛋白，该方法主要包括以下步骤：细胞裂解、亲和层析、洗脱和纯化。

方法细胞裂解首先需要将GST蛋白表达在适当的宿主中，例如大肠杆菌。

在细胞达到适当的生长阶段后，使用合适的方法将细胞裂解，使得目标蛋白释放到溶液中。

一种常用的裂解方法是超声波裂解，通过超声波震荡将细胞破碎。

亲和层析经过细胞裂解后，将得到的细胞裂解液通过亲和层析柱。

亲和层析柱通常使用含有还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合物质的树脂，例如glutathione agarose beads。

这种树脂与GST标签结合，使得GST标签的融合蛋白能够特异性地结合于柱子上。

通过洗脱液去除非特异结合蛋白，将目标蛋白纯化。

洗脱洗脱过程是将结合于柱子上的目标蛋白从固定相洗净。

一般采用含有高浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液，例如50 mM GSH。

洗脱液中的还原型谷胱甘肽与柱子上的结合物质竞争与GST标签结合，以此达到将GST蛋白洗脱下来。

纯化经过洗脱后，蛋白溶液中的GST蛋白含量较高。

为了进一步提高纯度，可以通过对溶液进行浓缩、去除低分子量杂质、调整溶液pH值等方法进行纯化。

常用的纯化方法包括丙酮沉淀法、离子交换柱层析法等。

注意事项•在实验过程中应严格操作，避免任何可能导致目标蛋白污染的情况发生。

•选择合适的表达宿主，不同的宿主可能会对GST蛋白的表达量和可溶性产生影响。

•在细胞裂解过程中，避免样品受到温度、剧烈振荡等因素的影响。

•注意亲和层析柱的操作方法，避免破损或污染。

•洗脱过程中注意还原型谷胱甘肽浓度和洗脱液的pH 值。

结论GST蛋白纯化是一种常见的蛋白质纯化方法，通过亲和层析技术可以实现对GST蛋白的高效纯化。

GST融合蛋白的纯化诱导和收集菌体在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。

18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。

IPTG浓度一般为0.1～1.0mM。

5000rpm 5min离心收集菌体。

亲和层析柱的制备取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。

将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。

每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。

在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。

将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。

收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。

0.45um过滤后加入亲和层析柱。

室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。

用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。

配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。

用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。

测各管洗脱液蛋白浓度。

PAGE电泳检测纯度。

亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。

或者按照beads使用说明书上的方法再生。

如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。

如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。

gst纯化蛋白步骤GST纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，它利用谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)的亲和性，将GST标签蛋白与GST结合亲和树脂进行结合，然后通过洗脱，最终得到纯化的目标蛋白。

下面将为大家介绍GST纯化蛋白的详细步骤。

1.构建重组蛋白表达载体：首先需要在目标蛋白编码基因的N端或C端加上GST标签，通常选择GST-N和GST-C两种方式。

将GST标签与目标蛋白基因连接后，将其插入合适的表达载体中。

2.转化宿主细胞：将构建好的重组表达载体转化到适合的宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌和酿酒酵母等。

3.表达目标蛋白：宿主细胞在适宜的培养条件下进行培养，使其产生大量重组蛋白。

常见的培养条件包括温度、培养基的选择和添加诱导物等。

4.细胞破碎：培养得到丰富的重组蛋白的细胞后，通过机械或化学方法将细胞破碎。

常用的方法有超声波破碎、高压均质破碎、冻融法和溶菌酶法等。

5.蛋白纯化：将细胞破碎液进行离心分离，去除残余细胞碎片。

接下来，将蛋白样品加入含有GST结合亲和树脂的柱子中，通过亲和吸附，在树脂上富集GST标签蛋白。

6.洗脱纯化蛋白：使用合适的洗脱缓冲液，可以脱离与亲和树脂结合的非特异性结合蛋白，并洗脱纯化的目标蛋白。

一般使用还原性缓冲液，可将目标蛋白从GST结合亲和树脂上彻底洗脱。

7.蛋白质浓缩：通过合适的方法，如超滤、溶液浓缩装置等，使纯化的目标蛋白浓缩到较高浓度。

8.纯化蛋白的分析：对纯化的目标蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，检测其纯度和分子量等指标。

通过上述步骤，可以得到较高纯度的GST标签蛋白。

需要注意的是，在步骤的选择和操作过程中，要根据目标蛋白的特性和所需纯度等要求进行调整，以获得更好的纯化效果。

希望本文对您进行GST纯化蛋白的实验有所帮助。

gst蛋白纯化原理GST蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理是利用谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）标签与谷胱甘肽的特异性结合来进行纯化。

GST标签可与谷胱甘肽通过二硫键共价亲和，然后通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。

具体步骤如下：1.构建GST标签融合表达载体：将GST基因的编码序列与目标蛋白的编码序列融合，构建GST-目标蛋白融合表达载体。

这样，在细胞中表达该融合蛋白时，GST标签会紧密结合在目标蛋白的C端或N 端。

2.转染和蛋白表达：将构建好的GST-目标蛋白融合表达载体转染到合适的宿主细胞（如大肠杆菌），使其产生大量的融合蛋白。

3.细胞裂解和融合蛋白的亲和层析：收获融合蛋白的细胞，通过细胞裂解等方法破坏细胞膜，释放融合蛋白。

然后，将溶解的细胞提取物加载到含有谷胱甘肽固定在琼脂糖（或其他载体）上的亲和层析柱中。

GST标签可以特异性地与琼脂糖上的谷胱甘肽结合。

4.洗脱：通过洗脱缓冲液来去除非特异性结合的蛋白质，保留GST-目标蛋白复合物。

洗脱通常使用还原剂（如谷胱甘肽）、低pH 或其他方式进行。

5.目标蛋白的解离：将GST标签从目标蛋白上解离，得到纯化的目标蛋白。

这可以通过特定的酶切位点（如蛋白酶TEV切割位点）和相应的酶进行酶切，使GST和目标蛋白分别释放。

6.纯化分析：对纯化的目标蛋白进行分析，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等方法，确认目标蛋白的纯度和完整性。

在进行GST蛋白纯化时，对于融合表达载体的设计和构建、宿主细胞的选择、裂解条件和亲和层析条件的优化等方面都需要合理考虑，以获得高质量的纯化目标蛋白。

gst融合蛋白的分离和纯化的原理
第一步，细胞裂解。

通常使用化学方法、物理方法或超声波等手段将目标蛋白所在的表达系统的细胞破碎，使蛋白从细胞溶液提取出来。

常用的细胞裂解方法有冻融法、超声波法和高压法等。

第二步，亲和层析。

利用GST融合蛋白在蛋白A/G琼脂糖或S-蛋白琼脂糖柱上与谷胱甘肽硫转移酶（GST）结合的特性，将目标蛋白与其他非特异性蛋白分离。

在这一步骤中，首先需要将裂解液与亲和层析树脂（例如：GST树脂）充分混合，使GST融合蛋白与亲和树脂结合；然后通过洗涤步骤，去除非特异性蛋白质的结合；最后，目标蛋白与亲和树脂的结合被破坏，并将其洗脱出来。

第三步，洗脱。

通过改变亲和层析树脂的pH值、离子浓度或添加特定试剂，破坏GST融合蛋白与亲和树脂的结合，实现目标蛋白从树脂上的洗脱。

常用的洗脱方法有酸洗脱、碱洗脱和还原洗脱。

第四步，纯化。

将洗脱的目标蛋白进行进一步的分离和纯化。

通常，还需要使用其他纯化方法，例如离心、电泳、层析等，进一步净化目标蛋白。

总的来说，GST融合蛋白的分离和纯化的原理是通过利用GST融合蛋白与亲和树脂之间的特异性结合，将目标蛋白与非特异性蛋白分离，然后通过改变条件破坏结合并将目标蛋白洗脱，最后进行进一步的纯化步骤，得到纯化后的目标蛋白。

这种方法具有简单、快速、高效的优点，在蛋白质分离和纯化的研究中得到广泛应用。

SOP6 谷胱甘肽亲和柱纯化带谷胱甘肽还原酶（GST)标签蛋白1.样品制备与“SOP Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白”中样品制备方法相同，裂解缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，0.5mM DTT ，1mM PMSF，1mM NaF ，protease inhibitors cocktail，pH7.5) 。

（PMSF，DTT，protease inhibitors cocktail在破菌前加入。

）适合于GST Pull- Down的细菌裂解液配方还有很多。

2.样品纯化Glutathione Beads亲和树脂灌装层析柱或直接使用Glutathione Beads预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。

2.1 平衡层析柱至工作温度，纯化过程可在室温或4℃进行。

2.2 将层析柱固定在支架上，让其流尽树脂保护液，快流干的时候用至少5倍体积的平衡/洗涤缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)冲洗柱子。

2.3 制备的蛋白样品与平衡/洗涤缓冲液1:1混合，加到平衡好的Glutathione Beads中（保证目的蛋白与Glutathione Beads充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流穿液。

2.4 用10～15倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液清洗柱床，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗涤液。

2.5 使用5～10倍柱床体积的洗脱缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0），收集洗脱液，即目的蛋白组分。

还原型Glutathione易氧化，也容易影响pH,需现用现配,同时注意调pH 8.0。

3.SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。

GST融合蛋白纯化方法1目的片段接入pGEX载体；2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h；3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）；以下步骤均在冰上操作：4超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h；5 2000 g，3min离心弃上清；6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清；7重复步骤6 两次；8加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min；92000 g，3 min离心，收集上清；10重复步骤8-9至少两次；11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度；12将蛋白置于-20℃保存。

P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条Thrombin cleavage(using thrombin produced by Amersham)1. Thrombin cleavage of eluted fusion protein bound to Sepharose* Mix 50 μl of thrombin (< 10 cleavage U/ml) solution and 950 μl of 1 x PBS for each ml of Glutathione Sepharose bed volumeAdd thrombin protease mixture to Glutathione Sepharose pelletGently shake or rotate the suspension at r.t. for 2-16 hCentrifuge the suspension at 500 x g for 5’ to pellet the beads and carefully transfer the eluted fraction to a clean tube.2. Thrombin cleavage of eluted fusion protein.Add 10 μl of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein. If the amount of fusion protein in the eluate has not been determined, add 80 μl (80 U) of thrombin for each ml of Glutathione Sepharose bed volume from with the fusion protein was eluted.Mix gently and incubate at r.t. (22-25C) for 2-16 h.Once digestion is complete, GST can be removed by first removing glutathione by extensive dialysis (2,000 vol/ml) against 1 x PBS followed by batch purification.。