套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒WSSV

2.建议经过以上养殖试验，在野生斑鳠驯养时，我们建议如下。

(1)不赞成用较大的鱼池进行驯养，在野生亲鱼的驯养阶段，每个驯养池面积10～50米2即可，但池壁和池底一定要光滑，水深要求1.5米以上。

(2)一定要设置藏匿物，如陶瓷坛或假山、小窝等，最好能保障每尾鱼有1个陶瓷坛或1个小洞穴，便于亲鱼隐藏栖息，更利于亲鱼伏击猎物。

(3)尽量稀养，给亲鱼营造相对独立的环境，最好是每个鱼池放养1～4尾亲鱼，放养规格也一定要一致，避免大鱼吃小鱼。

(4)在繁殖季节，雌鱼和雄鱼的比例尽量保持在1∶1左右，以免发情时相互攻击造成亲鱼伤害。

(5)保证充足的饵料、控制良好的水质环境也是提高斑鳠成活率的重要因素。

对虾白斑综合征病毒(White Spot SyndromeVirus,WSSV)是1992－1993年全国范围内对虾暴发性流行病的主要病原，到现在仍然没有能有效控制WSSV疫情的技术措施。

WSSV每年给我国对虾养殖业带来巨大经济损失，成为对虾养殖业可持续发展的主要障碍。

目前检测WSSV病原的方法有很多种，主要有目视观察法、组织学方法、电子显微技术、生化检验法、免疫学方法和分子生物学方法等。

其中分子生物学方法中PCR检测具有敏感性高、特异性高等特点，被广泛应用于对虾WSSV检测。

当前常用的对虾WSSV检测方法是一步PCR和套式PCR。

一步PCR的灵敏度较低，在实验过程中较易出现漏检的情况；套式PCR则是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段，以第一步PCR的扩增产物为模板，第二对引物结合在第一次PCR产物内部。

因此，套式PCR的扩增非常特异，相比一步PCR灵敏性、特异性更高。

套式PCR技术虽然具有较高的敏感性，但也容易出现假阳性，而且它是以一步PCR的产物为模板进行扩增，待检样品即使污染了微量的模板核酸，也会被检测为阳性。

如何在实验过程中有效避免假阳性的发生，一直是实验检测过程中普遍关注的问题。

本文拟分析讨论套式PCR假阳性形成的原因，提出预防及控制措施，减少实验过程中此问题的发生。

套式PCR法检测白斑综合征病毒(WSSV)因操作简便、灵敏度高等优点而被县级实验室广泛应用。

但基层实验室由于缺少专职实验操作员、管理较为松散等原因，经常出现假阳性和非特异性条带问题。

近年来，农业农村部每年开展水生动物防疫系统实验室检测能力验证工作，要求已经建成运行的县级水生动物防疫站至少参加一种疫病的实验室能力验证项目。

白斑综合征(WSD)由于发病率高、引起水产动物死亡率高从而成为众多县级实验室选择的检测项目。

昆山市水生动物疫病预防控制中心自2015年起开展WSSV的实验室检测工作，参照《白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法》(GB/T28630.2－2012)严格执行。

然而，在实验过程中，经常会出现假阳性和非特异性条带。

笔者与江苏省内多家县级水生动物防疫站交流后发现，以上两个问题在多家实验室普遍存在。

本文对套式PCR法检测WSSV假阳性和非特异性条带两个问题形成的原因加以分析，并提出预防和解决方法，旨在为广大基层实验室提供参考。

一、假阳性1.形成原因套式PCR的原理是采用两步法进行目的片段的扩增，第二步PCR以第一步PCR反应产物为模板。

这种方法检测灵敏度非常高，即使在反应体系中出现了极其微量的模板污染，也会造成假阳性。

(1)首次假阳性。

由于县级防疫实验室的检测人员并非专职实验操作员，一般为当地水产技术推广部门的工作人员兼职负责，所以在操作过程中，可能会出现枪头非一次性使用、动作幅度过大、手套未及时更换、PCR阳性产物不慎溢出等不当操作，这些都是导致假阳性的原因。

(2)非首次假阳性。

往往出现一次假阳性后，随着短期内实验次数的增加，假阳性发生的概率也会随之加大，这是由于在首次出现假阳性后，实验操作台、仪器设备和试剂耗材均有可能被污染，空气中也可能存在目的片段气溶胶颗粒。

2.预防措施假阳性一旦出现则很难消除，做好预防工作是十分必要的，具体做好以下3点。

(1)规范实验操作。

县级防疫站要加强对实验操作人员的理论培训和实操培训，使其增强意识和提升操作能力，尽可能地减少污染发生。

PCR 2核酸探针斑点杂交法检测痕量白斑综合征病毒(WSSV )①闫冬春②　董双林　黄 ③3　杨　冰3(中国海洋大学水产学院教育部水产养殖重点实验室　青岛266003)(3中国水产科学研究院黄海水产研究所　青岛266071)摘　要　设计了2对引物用于检测对虾白斑综合征病毒(WSS V ),外引物用于PCR 扩增,内引物用于合成探针进行斑点杂交。

结果表明,外引物PCR 2电泳的检出极限为1pg WSS V DNA ;PCR 产物经内探针斑点杂交,可检出10fg 的WSS V DNA ;单纯的内探针斑点杂交只能检测出1ng 以上的WSS V DNA 。

PCR 2斑点杂交的检测灵敏度比PCR 2电泳高2个数量级,比单纯斑点杂交高5个数量级。

S outhern 杂交表明,PCR 2斑点杂交检测WSS V 特异可靠。

该方法可用于痕量WSS V 的检测。

关键词　PCR ,斑点杂交,白斑综合征病毒0　引言白斑综合征病毒(White spot syndrome virus ,WSS V )自1992～1993年在亚洲东部出现后,在亚洲及印度2太平洋的几乎所有对虾养殖地区迅速传播开来,每年造成对虾大量死亡,给生产带来巨大损失,是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒[1]。

目前,分子生物学的核酸探针技术及PCR 技术都已应用到白斑综合征病毒的检测[227]。

核酸探针斑点杂交分析法检测对虾病毒不需提取DNA ,所需试剂和仪器简单,且一次可对大量样品(可达上百个)进行测定,易于推广。

目前核酸探针斑点杂交试剂盒已实现商品化并得到广泛应用。

但是,因单纯的核酸探针斑点杂交是直接检测存在于病虾体内的WSS V DNA ,故灵敏度较低。

PCR 方法对病毒DNA 进行了大量扩增,故其灵敏度高于斑点杂交,但常规PCR 2电泳检测过程处理样品量少,效率较低,而且由于样品中的DNA 来源复杂等原因,可能出现假阳性和假阴性。

在实验研究中,我们探讨了将PCR 与核酸探针方法结合起来,先对样品DNA 进行PCR 扩增,再用内探针进行斑点杂交,则检测的灵敏度和可靠性都会提高。

白斑综合征病毒（WSSV）核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）使用说明书（使用前请详细阅读本说明书）【产品名称】通用名称：白斑综合征病毒（WSSV）核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）英文名称：PCR Detection Kit for White Spot Syndrome Virus (Fluorescent Probe Assay) 【包装规格】48测试/盒【产品编号】FZ001AF2【产品简介】本试剂盒适用于水产样本中白斑综合征病毒（WSSV）的检测。

【检测原理】基于实时荧光PCR技术，针对WSSV特异性基因设计引物和荧光探针并优化反应所需试剂组分，加入待检样品核酸即可进行扩增反应。

在扩增过程中，荧光探针与目的基因片段结合，可被Taq酶分解并产生荧光信号，此时荧光定量PCR仪可识别该荧光信号，同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线，进而判定WSSV是否检出。

【产品组分】组分名称规格×数量裂解液 1 mL×2管阳性对照200 μL×1管阴性对照200 μL×1管预混液 1 mL×1管说明书1份【储存条件与保质期】-20℃储存，有效期为9个月，避免反复冻融。

【灵敏度】最低检验限：10-100 Copies/Test【所需其他材料和适用仪器】荧光定量PCR仪（具有能够检测FAM标记的荧光通道）、高速离心机、移液器、移液枪头及离心管等。

【使用指南】1.样品前处理取50 mg左右的组织样品（对虾鳃、胃及各期虾苗幼体）于玻璃匀浆器中匀浆，匀浆后置于1.5 mL离心管中。

2.DNA提取1）对上述处理好的样品加入50 μL裂解液，100℃恒温处理10分钟，13000 rpm离心5分钟，上清即含待检测样品DNA。

如不立刻开展检测请将上清液转移至0.2mL无菌离心管中，-20℃保存。

2）DNA的提取也可以采用商品化的水生动物病毒核酸提取试剂盒进行提取，请严格按照试剂盒说明书进行操作。

感染白斑综合征病毒的斑节对虾免疫酶变化特征摘要:研究了斑节对虾(Penaeus monodon)感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后的发病情况和4种免疫酶活性的变化特征｡通过对斑节对虾进行WSSV急性攻毒试验,发现在感染50 h左右出现死亡高峰,感染60 h后大部分死亡虾出现明显的白斑｡血液酚氧化物酶(PO)､过氧化物酶(POD)､超氧化物歧化酶(SOD)､酸性磷酸酶(ACP)活性在感染WSSV后都呈现先降低再升高再降低的趋势,并在感染后60 h左右,活性达到最大值｡肝脏､肌肉组织中的ACP､SOD活性变化规律与其在血液中的变化类似,肝脏中的ACP､SOD活性明显高于肌肉组织中的活性｡关键词:斑节对虾;白斑综合征病毒(WSSV);免疫酶Characteristics of Immuno-enzymes of Penaeus monodon Infected with White Spot Syndrome VirusAbstract: The mortality of WSSV-infected Penaeus monodon, and the enzyme avtivity for four immuno-enzymes were investigated. It found that the highest shrimp mortality appeared around 50 hours, and the white spots occurred on most of the died shrimps around 60 hours after WSSV infected. The activity of phenoloxidase(PO),peroxidase(POD), superoxide dismutase (SOD) and acid phosphatase(ACP) in blood decreased at first after WSSV infected, then increased to the highest enzyme avtivity around 60 hours and decreased at last. The trends of SOD and ACP activity in liver and muscle were similar to the changes in blood, however, the activity of SOD and ACP in liver were higher than those in muscle.Key words: Penaeus monodon; WSSV; immuno-enzymes甲壳类动物缺乏由抗体介导的免疫反应,不能通过抗原抗体反应来达到自我保护的目的｡其免疫机制为非特异性免疫,通过血细胞及体液因子的活性来抵抗病原微生物的入侵｡血液酚氧化物酶(PO)､超氧化物歧化酶(SOD)､过氧化物酶(POD)以及酸性磷酸酶(ACP)等免疫酶的活性高低经常被用作评价免疫强弱的指标｡对虾的非特异性免疫系统也受很多因素的影响,比如蜕壳､水温突变､溶氧高低､外界刺激和病毒入侵等｡关于虾类的免疫应答机制,已经有很多研究报道,刘庆慧等[1]对中国对虾感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后血细胞数量变化做了研究报道;Songa等[2]分析了感染桃拉病毒后凡纳斌对虾血淋巴和肌肉组成的生化变化;Yoganandhan等[3]报道印度明对虾在感染WSSV后,血淋巴细胞密度和血清蛋白浓度等免疫参数与正常虾有很大差异;宋林生等[4]报道过南美白对虾感染WSSV后SOD活性和过氧化氢酶(CAT)活性的变化｡还有很多其他学者关于对虾免疫反应机理的报道,但这些文献资料所阐述的反应规律不尽相同,有不同的试验结果和理论解释｡由于WSSV病毒病已经成为制约对虾养殖业发展的主要因素,而对虾的抗病能力主要通过非特异性免疫系统实现,因此对参与非特异性免疫的各种免疫酶活性的研究是对虾抗病研究的热点之一｡本研究通过斑节对虾(Penaeus monodon)WSSV急性感染试验,探讨了斑节对虾在感染WSSV后的发病情况和4种免疫酶在体内不同组织的活性变化｡1材料和方法1.1试验材料1.1.1试验用虾试验用斑节对虾由中国水产科学研究院南海水产研究所三亚热带水产研究中心提供｡挑选大小均匀(7.0±0.2)cm､活力旺盛的个体进行WSSV 急性攻毒试验｡1.1.2WSSV病原用白斑症状明显的斑节对虾作为感染材料(PCR检测WSSV阳性,超低温保存)｡取其肌肉组织0.1 g,加入1 mL磷酸盐缓冲液(NaCl 8 g,KCl 0.2 g,KHPO4 1.44 g,KH2PO4 0.24 g,用HCl调节pH值至7.4,定容至1 000 mL,灭菌常温保存)冰浴匀浆,10 000 r/min离心20 min后取上清液,上清液经0.45 μm滤膜过滤后稀释1 000倍作为试验用病毒液｡1.1.3试剂左旋多巴(L-dopa)(Sigma公司生产);PCR buffer､dNTP､Taq DNA聚合酶等购自大连宝生物工程公司;ACP检测试剂盒､SOD检测试剂盒､考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;邻苯二胺等试剂均为国产分析纯｡1.2试验方法1.2.1WSSV急性攻毒试验试验前随机取虾10尾,进行WSSV病原抽样检测,检测方法采用巢式PCR法[5]｡攻毒试验设感染组和对照组,感染组4个平行,对照组4个平行,每个平行30尾,用于统计试验虾的死亡时间｡另设与前述相同的两个试验组,用于采集血液､肝组织和肌肉组织; 感染组每尾虾用1 mL一次性注射器注射病毒液0.05 mL;对照组每尾虾注射PBS 0.05 mL｡试验在16个500 L的玻璃钢桶中进行｡记录每尾虾的死亡时间,并在试验开始后0､12､24､36､48､60､72 h采集发病对虾的血液､肝组织和肌肉组织｡肝组织和肌肉组织采集后及时冷冻保存;血液采集后4℃保存过夜,第二天离心取血清｡试验期间,水温29~31℃,盐度3.0%~3.2%,pH值7.8~8.2,溶氧6.6~7.0 mg/L｡1.2.2免疫酶活性检测肝组织和肌肉组织加0.9%的生理盐水研磨成10%的组织匀浆,离心后取上清液｡血清和上清液用于免疫酶活性的检测｡1)PO活性的检测｡以L-dopa为底物,采用改进的Ashida[6]的方法按以下步骤进行测定:①配制50 mL 0.01 mol/L的L-dopa(L-dopa 0.0986 g,去离子水50 mL)和0.1 mol/L pH值为6.0的磷酸盐缓冲液(K2HPO4 1 mol/L 13.2 mL,KH2PO4 1 mol/L 86.8 mL,稀释至1 000 mL);②在96孔酶标板中,每孔加200 μL的0.1 mol/L pH 值为6.0的磷酸盐缓冲液;③每孔再加入10 μL血清和10 μL 0.01 mol/L的L-dopa,室温下混匀;④置于酶标仪中,室温28℃左右,固定吸收波长490 nm,每隔2 min测量1次,连续测量10次,测其血清酶动力学OD490值;⑤以OD490对反应时间作图,以试验条件下每分钟OD490值增加0.001定义为一个酶活力单位｡2)POD相对活性的检测,采用改进的雷质文等[7]的方法:①在96孔酶标板中加入血淋巴上清液,20 μL/孔;②加入180 μL显色缓冲液(一水柠檬酸7.3 g,Na2HPO4·2H2O 11.86 g,去离子水定容至1 000 mL);③置于酶标仪中,读取490 nm处的OD值(A1);④向所有样品孔中加入20 μL显色液(邻苯二胺4 mg,30% H2O2 4 μL;显色缓冲液10 mL);⑤置酶标仪中摇匀后,避光显色15 min,读取490 nm处的OD值(A2);⑥血淋巴上清液中POD 相对活性以APOD=(A2-A1)×稀释倍数表示｡SOD､ACP活性及蛋白质浓度的检测,按南京建成试剂盒内说明进行｡1.3数据处理统计不同时间段虾的死亡个数,计算免疫酶活性高低,用SPSS 16.0对不同时间点4种免疫酶的活性高低进行单因素方差分析,并做Duncan’s多重比较,结果以平均数±标准差来表示｡2结果2.1斑节对虾WSSV急性感染后的发病情况斑节对虾在抽样检测中均为WSSV阴性｡如图1所示,综合感染组4个平行斑节对虾的发病情况发现,注射感染24 h前后,部分虾活力减弱,弹跳无力,对外界刺激反应迟钝;感染32 h左右开始有虾死亡;感染50 h后,部分虾的虾壳轻度红色,头胸甲膨大易剥落,肝肥大,血液变稀,凝血力下降,出现死亡高峰;感染54 h左右,出现第一尾带有明显白斑的死虾｡在感染60 h左右,大部分死亡对虾出现明显白斑｡对照组试验期间没有死亡对虾｡2.2免疫酶活性分析2.2.1血液PO活性的变化特征斑节对虾感染WSSV后,0~24 h血液PO活性下降;24 h后,活性开始恢复,到感染60 h活性达到峰值,并且略高于初始活性;60~72 h,血液PO活性又开始下降;感染0､60 h血液PO活性与感染24､36､48､72 h血液PO 活性存在显著差异(P<0.05)(图2)｡对照组7个时间点血液PO活性大小范围(6.08±0.18)U,不同时间点活性基本相同,没有显著差异｡2.2.2血液POD相对活性的变化特征感染WSSV后,0~36 h血液POD相对活性下降;36 h后,相对活性开始恢复,到60 h相对活性达到峰值(图3)｡各时间点血液POD相对活性没有显著差异｡对照组7个时间点血液POD相对活性大小范围(2.22±0.18),比较稳定,活性基本相同｡2.2.3不同组织ACP活性的变化特征由表1可知,血液､肌肉组织､肝脏组织ACP 活性随感染时间的延长均有先降低再升高再降低这样一个过程,与血液PO和POD活性随感染时间的变化(图2和图3)类似｡血液ACP活性在感染60 h达到峰值,与其他时间点ACP活性存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01);肝脏与肌肉ACP活性在感染36 h达到峰值,肌肉组织ACP活性随感染时间延长没有显著差异;肝脏组织36 h ACP活性与12､24 h存在出现极显著差异(P<0.01);另外肝组织ACP活性明显高于肌肉组织｡对照组血液､肌肉及肝脏7个时间点ACP活性没有显著差异,分别与其0 h活性值相近｡2.2.4不同组织SOD活性的变化特征由表2可知,三种组织SOD活性随感染时间的变化与血液PO和POD的变化(图2和图3)类似｡血液与肝脏SOD活性在感染60 h达到峰值;肌肉SOD活性在感染36~48 h达到最大值;60 h血液SOD活性与24 h存在显著差异(P<0.05);36 h和48 h肌肉SOD活性与12､60､72 h存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01);肝脏组织SOD活性明显高于肌肉组织;对照组血液､肌肉及肝脏7个时间点SOD活性没有显著差异,分别与其0 h的活性值相近｡3讨论Tang等[8]用病毒定量检测的方式研究了病毒在斑节对虾体内的扩增过程,结果显示0~24 h为缓慢扩增期,24~48 h为指数增长期,48 h后为平台期｡本试验所得死亡曲线(图1)与病毒扩增过程吻合,32 h左右斑节对虾出现死亡,说明已经到了病毒大量扩增的阶段,体质较弱的开始死亡;48 h后病毒扩增到了平台期,病毒粒子大量存在,此时为本试验感染50 h左右斑节对虾的死亡高峰｡感染50 h内死亡的对虾,在甲壳上没有明显的白斑;而感染60 h后死亡对虾,甲壳上大部分有明显白斑,这一结果与谢数涛等[9]的研究结果基本吻合｡通过与已报道的研究结果进行比较,本试验所使用的病毒材料在感染斑节对虾时的毒力与10年前没有明显变化,具有广谱性特征,因此用这些病毒感染斑节对虾后所测定的免疫酶活性的结果,具有一定的代表性｡PO是一种氧化还原酶,酚氧化物酶原激活系统是一个复杂的酶级联系统,该系统中的因子以非活化状态酚氧化酶原的形态存在于血细胞颗粒中,类似于高等动物的补体激活系统｡王雷等[10]､江晓路等[11]报道了中国对虾PO活性的存在和激活机制,认为PO在甲壳动物中起识别和防御作用｡POD的功能是通过过氧化氢酶的作用,将有害的细胞代谢产物过氧化氢分解成水和氧气,起到细胞保护作用,但POD在免疫反应中的地位仍不十分清楚｡ACP是一种磷酸单酯酶,在对虾体内具有清除､消化､水解异物的作用｡刘树青等[12]认为ACP是巨噬细胞溶酶体酶的标志酶,在甲壳类血液和血细胞中有重要的防御功能｡SOD是生物体内非常重要的一种抗氧化酶,能保护功能大分子不被破坏､减缓机体衰老｡近年来的研究表明,SOD活性与生物的免疫水平密切相关,可以用它的活性变化作为衡量对虾免疫状态的指标,甚至是定量指标｡本试验通过对斑节对虾进行WSSV急性攻毒试验,动态检测了这几个指标在不同感染时间的活性,除血液POD､肝脏SOD和肌肉ACP活性在不同的感染时间变化不显著以外,其他的都存在显著(P<0.05)或极显著性差异(P<0.01),加之在对照组中4种免疫酶的活性很稳定,可以推测PO､SOD､ACP的活性变化与WSSV感染复制有关,是斑节对虾机体应激后所作出的防御反应｡综合本试验中PO､POD､SOD和ACP活性在血淋巴､肌肉和肝脏中的变化,可以发现它们都有在感染初期活性降低,感染中期活性升高,感染后期活性再次降低的规律｡这一结论与邱德全等[13]研究在不同氨氮浓度下携带WSSV的凡纳滨对虾发病后酚氧化物酶酶活性变化规律具有一致性;与黄旭雄等[14]试验中明对虾急性感染哈维弧菌和WSSV后,血液SOD､PO变化规律相类似｡但是关于感染病菌后血液免疫酶的活性变化,不同学者有不同的结论,有报道显示中国对虾在注射一定量弧菌和大肠杆菌后,其血淋巴PO活性降低[10],严重感染WSSV的中国对虾PO活性也显著下降[7]｡同时也有报道称给斑节对虾投喂芽孢杆菌后,PO活性比对照组显著增高[15];用活的嗜水气单胞菌注射罗氏沼虾,血液PO活性24 h内升高4倍后又恢复到原来水平[16]｡本试验中4种免疫酶活性变化与上述报道也有类似之处,PO､SOD等感染72 h后最终酶活性也都显著下降,符合酶活性在感染后下降的观点,而且在最终活性降低之前有一个活性恢复的过程,这也与酶活性升高观点相吻合｡另外肝脏组织中的ACP､SOD活性均高于肌肉组织可能是由于肝脏为免疫器官的原因｡参考文献:[1] 刘庆慧,黄捷,杨冰,等. 人工选育中国对虾两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化[J]. 海洋水产研究,2005,26(6):22-27.[2] SONGA Y L,YU C L,LIEN T W,et al. 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对南美白对虾养殖中常见细菌性疾病南美白对虾是一种重要的养殖水产种类，受到了广大养殖户和消费者的喜爱。

对南美白对虾养殖中常见细菌性疾病对养殖业构成了一定的威胁。

本文将就南美白对虾养殖中常见的细菌性疾病进行介绍，以便养殖户加强对这些疾病的防范和控制。

1. 白斑综合症病（WSS）白斑综合症病（WSS）是一种引起南美白对虾大规模死亡的重要细菌性疾病，由白斑综合症病毒（WSSV）引起。

感染虾只后，虾体表面出现不规则的白色斑点，并伴随着虾体的变软和变脆。

患病的虾极易被其他疾病或环境因素所致死亡。

预防和控制白斑综合症病的关键在于增强养殖场的生物安全措施。

养殖户应加强对水质的管理，保持水质清洁，避免废水和有害物质的污染。

定期清除池塘底泥和虾殻，减少病原体的滋生。

关于病毒的研究、防治和防范工作也应该得到加强。

2. 顶芽弯曲病（EHP）顶芽弯曲病（EHP）是一种常见的南美白对虾疾病，由顶芽弯曲病菌引起。

患病虾只头部显著变形，其顶芽出现弯曲或扭曲的症状。

患病虾体色变深，行动迟缓，极易受其他病原体的感染。

对于顶芽弯曲病，预防和控制的关键在于保持养殖水域和设施的清洁卫生，并提供适宜的养殖环境。

养殖户应加强对水质和养殖环境的管理，避免水域的污染和有害物质的积累。

饲料的合理投喂和养殖密度的控制也是预防顶芽弯曲病的重要措施。

3. 白肠病白肠病是南美白对虾养殖中常见的细菌性疾病，由白肠病菌引起。

患病虾只表现为食欲不振、消瘦、腹部肿胀和排泄物异常。

白肠病一旦发生，极易导致养殖场的虾只大规模死亡。

预防和控制白肠病的关键在于加强养殖场的卫生管理和健康监测。

水体清洁和无菌是预防白肠病的重要手段，养殖户应加强对养殖水域的管理，减少废水的排放和有害物质的积累。

定期检查和监测虾只的健康状况，发现异常情况及时采取措施进行治疗和隔离。

4. 中肠球菌病中肠球菌病是一种由中肠球菌引起的南美白对虾细菌性疾病，主要表现为虾只中肠内出现黏液块状物和肠道纤毛丢失。

中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗白斑综合征病毒（WSSV）候选基因分析中国对虾是我国主要的经济水产养殖品种，二十世纪九十年代白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）暴发以来其产业受到严重影响。

近年来随着种苗和养殖水平整体的提高，我国对虾养殖业逐年发展。

但时至今日，WSSV依旧是影响对虾养殖业的主要病原之一。

从根本上解决对虾养殖业中WSSV等问题的关键是选育出抗病能力强和生长速度快等优良性状兼顾的中国对虾新品种。

对于阈性状和低遗传力性状，将传统选育手段和先进的分子生物学技术相结合，能提高选择准确性，加快育种进程。

本研究以中国对虾“黄海2号”454转录组测序数据为基础，以RACE、基因克隆、常规测序、HRM、ELISA、real-timePCR等常规生物学技术为平台，进行中国对虾抗WSSV性状候选基因和SNP分析，为中国对虾抗WSSV育种提供理论依据和实践材料。

主要研究包括首次获得中国对虾MEK、ERK、Ras和组织蛋白酶B基因序列；开发、分析各基因内SNP位点；进行正常中国对虾和感染WSSV的中国对虾不同组织内各基因表达水平分析；感染中国对虾WSSV复制特点以及抑制中国对虾MEK/ERK信号转导通路对WSSV复制水平影响；挑选454转录组测序中的候选SNP位点；利用HRM技术在抗病组和敏感组内进行基因分型，统计遗传多态性信息和进行抗病关联分析等。

具体内容包括：1、报道了中国对虾MEK（FcMEK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KJ135020）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。

感染WSSV的中国对虾，FcMEK mRNA在肝胰腺中6h和48h呈现上调表达，12h和24h转录水平下降。

FcMEK mRNA在鳃中12h、24h和48h转录水平上升，6h转录水平下降。

FcMEK mRNA在肌肉中6h、12h、24h和48h转录水平上升。

对虾白斑综合疰病毒（ｗｓｓｖ）单克瞻抗体中和特性的掰｝究摘要对虾自斑综合痉瘸毒（ＷＳＳＶ）瘸是世界对虾养戆业危害严重的瘸害，至今为止仍没有有效防治该病的药物和疫菌。

由于中和单克隆抗体的产生与病毒的保护毪撼覆位点紧密掇关，本论文醭究ＴＷＳＳＶ单克隧撬薅戆中秘特链，翘步探讨了ＷＳＳＶ的保护性抗原结合位点。

研究结果有助于对ＷＳＳＶ病毒特异性的认躲，并将态裁备ＷＳＳＶ独特鬃疫蓥、合成默痰蓠及綦霆工程痰萤等搀茯理论蔹据和实践指导。

零论文通＿ｌ建蔗糖糅度离心提纯煎｜较高纯度和密度的ＷＳＳＶ，并耱用窀镜和ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶电泳对病毒进行了形态和结构分析，进而利用ＷＳＳＶ作为抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小囱鼠，将免疫小鼠的脾细胞与Ｐ３－Ｘ６３．ＡｇＳＵｌ骨髓瘤细胞融合，虚弱阏接免疫荧先攘体技术（瓤娃）戆逸获褥粥经杂交瘸细腿，最后共褥到２２椿阳性杂交瘤细胞株，并克隆了能稳定分泌强阳性单克隧抗体的８株杂交瘤细胞攮。

利用本研究制备的８株单克隆抗体和实验室原先制备的８株单克隆抗体拭１８袜革克隆抗体，疆宠氏原鏊虾（ｅａｍｂａｒｕｓｐｒｏｄａｒｋ／０为动耱穰壅，繇究了辩蠡下白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）单克隰抗体对ＷＳＳＶ在体内感染增魉的中和阻断作用。

并且，研究了瀹合单克隆抗体进行螯虾体内中和实验豹效果，探讨了筚抗混合后对中葶鞋力的影响。

中鄹特性的研究主簧是通过渡射单觉隆抗体朔病毒混会液后观察记蒙螯虾的死亡情况和进行免疫荧光抗体技术检测病毒来判断各种单克隆抗体对旗毒夔孛秘毙力。

缝累表明：各秘擎支隆捻体均鸯不网强波懿病鸯审和活性，其中单克隆抗体２８２、２Ｄ２和４Ｆ３的中和效果较佳，单克隆抗体混合聪其中和力反雨蠢掰下降。

关键蠲：对酆；蠡邈综套瘥瘸毒；竟氏爨警蛉：中期革克睡抗体对虾白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）单克瞧抗体中和特性的研究ＡｂｓｔｒａｃｔＷｍｔｅＳｐｏｔＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｉｓｔｈｅｍｏｓｔｈａｒｍｆｕｌａｎｄｔｈｅｍｏｓｔｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｓｈｒｉｍｐｖｉｒｕｓ，ｂｕｔｎｏｍｅｄｉｃａｍｅｎｔａｎｄｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＷＳＳＶａｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｕｐｔｏｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔ．ｎｌｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｒｅｐｏｓｅｄｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｖｅｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＷＳＳＶ，ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｌａｎｅｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＷＳＳＶａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＷＳＳＶｗｈｉｃｈｗｉｌｌａｃｃｅｌｅｒａｔｅｔｈｅａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｂａｓａｌｔｈｅｏｒｙｏｆＷＳＳＶａｎｄｏｆｆｅｒｔｈｅｏｒｙｆｏｕｎｄａｔｉｏｎａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅｇｕｉｄａｎｃｅｔｏｄｅｖｅｌｏｐｉｄｉｏｔｙｐｉｃｖａｃｃｉｎｅ．ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｖａｃｃｉｎｅａｎｄｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｖａｃｃｉｎｅ．ＮｅａｔａｎｄｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｏｆＷＳＳＶｃｏｕｌｄｂｅｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄｇａｉｎｅｄｂｙｕｓｅｏｆｓｕｃｒｏｓｅｇｒａｄｓ’ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，ａｎｄｔｈｅｖｉｒａｌｓｔｒｕｃｔｌｌｒｅｏｆＷＳＳＶｗａｓａｎａｌｙｓｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄＳＤＳ－ＰＡＧＥｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，４ｗｅｅｋｓＢａｉｂ／ｃｍｏｕｓｅｗａｓｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈＷＳＳＶｏｆｓｈｒｉｍｐ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）ＷａｓｕｓｅｄａｓｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｅｅｌｌｆｕｓｉｏｎｏｆＷＳＳｖ－ｉｍｎｌｕｎｅｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓｗｉｔｈＰ３－Ｘ６３－Ａ９８Ｕｌｍｙｅｌｏｍａｃｅｌｌｓ，ａｎｄｈｙｂｒｉｄｏｍａｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆＩｍｍｔｍｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｓ（瑾Ａ）．２２ｓｔｒａｉｎｓｏｆｈｙｂｆｉｄｏｍａｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＷＳＳＶｏｆｓｈｒｉｍｐｗｅｒｅｇａｉｎｅｄａｎｄｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｅＡｔｏｔａｌｏｆ１６ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)方法在小龙虾养殖中应用探索陈俊豪;丁文岭;方丽君;徐洲;罗春景【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2018(039)011【总页数】3页(P5-7)【作者】陈俊豪;丁文岭;方丽君;徐洲;罗春景【作者单位】扬州市江都区水产管理站,江苏扬州225200;扬州市江都区水产管理站,江苏扬州225200;扬州市江都区水产管理站,江苏扬州225200;扬州市江都区小纪镇神潼塔岳水产养殖场,江苏扬州225241;扬州市江都区丁沟镇农业推广中心,江苏扬州225235【正文语种】中文随着小龙虾池塘养殖和稻虾综合种养产业迅速发展，小龙虾白斑综合征病害问题也日渐突出。

其病原为一种环状双链DNA病毒，能感染对虾、螯虾等各种虾类，该病毒病流行快、发病广、致死率高，对小龙虾养殖业造成了严重的经济损失。

由于白斑综合征病毒类病原侵染动物体后在宿主细胞内进行复制繁殖，一般常规药物无法在不伤害宿主细胞的情况下将其消灭，故而该病毒性疾病目前尚无特效治疗药物。

因此在小龙虾亲本繁殖、苗种放养及养殖环节中对病原的早期诊断和及早处理带毒动物体，及时进行预测预报，并在基层生产指导单位建立快速准确灵敏的WSSV检测方法，对科学养殖指导工作有着重要的意义，对实际养殖生产的帮助也是显而易见的。

PCR检测方法是一项分子生物学技术，用于放大特定的核酸片段，具有特异性强、灵敏度高、样本纯度要求低、简便快速的特点，已广泛应用于医学和生物学实验室以及传染病病原的检测。

自20世纪末，对于WSSV的PCR检测方法就已有了系统研究，可对于将WSSV的PCR检测方法引入生产实践中，为养殖户进行病害的预测预报，这在扬州地区尚属首次。

近年来小龙虾白斑综合征在我国湖北、江苏、安徽等小龙虾主要养殖区域危害严重，每年的5月至6月和9月至10月，水温在20～28℃为流行高峰，一旦发病，病死率高达90%以上。

笔者在2018年上半年走访了江苏省扬州市江都区两户小龙虾养殖户，皆因苗种携带了WSSV，在2017年秋后和2018年春夏期间，存塘小龙虾急剧减少，导致养殖池塘血本无归。