微针注射甜玉米胚芽gus基因转化瞬时表达研究_刘立岩

摘要 ［目的］研究微针注射甜玉米（ Zea mays L． ） 胚芽 gus 基因转化瞬时表达，为玉米遗传转化的进一步研究奠定基础。［方法］以农杆 菌为介导，采用 gus 基因瞬时表达技术，建立了胚芽注射开放性基因转化体系。［结果］3 mm 长的胚芽为最适转化受体； 农杆菌 EHA105 菌液浓度最适 OD 值为 0． 558 ～ 0． 630； gus 基因转化最适共培养天数为 3 d。在以上最适转化条件下，微针注射胚芽生长点基因转化率为 1%。［结论］该研究可为改良甜玉米遗传性状，培育基因工程新品种提供参考。 关键词 甜玉米； 微针； 注射； 胚芽； 基因转化； 瞬时表达 中图分类号 S 513 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2011） 15 － 08883 － 02
图 5 生长点 gus 基因转化结果 Fig． 5 Transformation of gus in growing point
3 结论与讨论 该研究应用微针注射胚芽生长点的方法进行基因转化，
采用了绕开愈伤组织再生的转化途径，以萌动的胚作为受 体，使转化变得简单方便，建立了快捷、稳定、统一的转化体 系。试验中，以根癌农杆菌侵染玉米胚芽生长点的基因转化 中得到的瞬时表达率受多种因素影响，只有当所选胚芽长为 3 mm、菌液浓度达到对数生长期（ OD 值 0． 500 左右） 、共培养 3 d 时，转基因成功率相对较高，不过也仅仅达到 1% ，而盾片 的转化率却很高。从理论上讲，生长点附近的细胞分裂能力 更强，生长更旺盛，更利于农杆菌的侵染，并将所携带的质粒 载体转化进细胞里，然后转录翻译出可以检测到的 gus 蛋 白。可结果却是盾片的转化率高，究其原因可能是在转化过 程中，盾片上的菌液量远远高于生长点附近的菌液量，为盾 片的转化提供了充足的菌液侵染环境，并且盾片可能存在某 种内源的酚类物质，类似于乙酰丁香酮的作用。农杆菌对这 些酚类化合物具有趋化性，它们作为创伤诱导分子诱导农杆 菌 vir 基因活化及表达，极大地增强了菌株的转化能力。
DOI:10.13989/ki.0517-6611.2011.15.190
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39（ 15） ： 8883 － 8884，8886
责任编辑 姜丽 责任校对 傅真治
微针注射甜玉米胚芽 gus 基因转化瞬时表达研究
刘立岩 （ 铁岭师范高等专科学校，辽宁铁岭 1
图 2 微针注射生长点位置 Fig． 2 Inject position of growing point by Microneedle
斑点或蓝色面胚芽（ 图 3） ，即为 gus 基因瞬时表达的玉米。
图 4 最适芽长的选择试验结果 Fig． 4 The test result of the most suitable length of buds
在此条件下，选取原始玉米 200 粒，进行生长点转化数统计 （ 图 5） ，计算转化率，为 1% 。
图 3 gus 基因转化结果 Fig． 3 Transformation of gus
1． 5 转化率统计 转化率 = 转化数 / 原始玉米数 × 100% ， 生长点转化率 = 生长点转化数 / 原始玉米数 × 100% 。其中， 转化数是指出现蓝斑的玉米数，即 gus 基因表达出蛋白并被 染色的玉米数，包括玉米盾片、生长点； 原始玉米数是指被转 入农杆菌的玉米数； 生长点转化数是指生长点出现蓝斑的玉 米数。 2 结果与分析 2． 1 玉米转基因最适菌液浓度 选取胚芽长度在 2 ～ 4 mm 的原始玉米数 100 粒，24 ℃ 下共培养 3 d。当玉米转基因菌 液浓度 OD 值分别是 0． 464、0． 558、0． 630、0． 745、0． 881 时，测 得 EHA105 菌种的转化率分别为 9% 、14% 、12% 、9% 、6% 。 这表明 OD 值为 0． 558 ～ 0． 630 时，EHA105 菌种的转化率 较高。 2． 2 玉米转基因最适芽长 分别选取胚芽长为 2、3、4、5 mm 的原始玉米各 100 粒，设农杆菌菌液浓度 OD 值为 0． 50 ～ 0． 70，24 ℃ 下共培养 3 d，统计得到的甜玉米基因转化率分 别为 8% 、14% 、11% 、6% ，表明芽长为 3 mm 时转化率最高 （ 图 4） 。 2． 3 最适共培养天数 设农杆菌菌液浓度 OD 值为 0． 550 ～ 0． 650，选取胚芽长为 3 mm 的原始玉米数 100 粒，24 ℃ 下 分别培养 2、3、4、5 d，统计得到的甜玉米基因转化率分别为 10% 、14% 、13% 、11% ，表明共培养 3 d 时转化率最高。 2． 4 最适条件下生长点转化率 通过对转化条件的摸索， 可知使 用 菌 种 EHA105，当 农 杆 菌 菌 液 OD 值 为 0． 550 ～ 0． 650，芽长为 3 mm 时，24 ℃ 下共培养 3 d，为最佳转化条件。
甜玉米是杂交品种，基因资源已经匮乏。因此，利用基 因转化技术，对其产量和品质进行改良，已成为研究的重要 课题。近年来，甜玉米的遗传转化取得了突破性进展。胡建 广等以超甜玉米幼胚为材料，建立了农杆菌介导转化的条 件，获得可育的转基因超甜玉米株系［1］，并通过优化基因枪 转化条件，获得 18 个可育的转基因超甜玉米株系［2］。李余良 等利用基因枪法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因转化胚性愈伤 组织，建立了稳定、高效的超甜玉米转基因再生成株体系［3］。 另外，李余良等以超甜玉米幼胚诱导的愈伤组织为受体材 料，利用基因枪法共转化 Bt 和 GNA 基因，获得再生植株［4］。 以上研究中多数采用以幼胚为起始材料，利用基因枪法进行 转化，研究中存在一些难点： 利用基因枪转化，容易导致转录 后的沉默［5］，转基因后代无法稳定遗传，转化效率低（ 0． 1% ～ 1． 0% ） ［6］，且需要特殊的仪器，费用较高，这限制了基因枪 的应用； 另外，基因转化中又多以幼胚为起始材料，这大大地 限制了转化材料的来源。因此需要探索一条能够绕开愈伤 组织再生且容易获得较高质量外植体来源的转化新途径。 为此，笔者选用玉米胚芽，采用微针注射法，由农杆菌介导， 探索玉米的遗传转化，用 gus 基因的瞬时表达情况来摸索玉 米遗传转化的条件，旨在为玉米遗传转化的进一步研究提供 参考。 1 材料与方法 1． 1 试验材料 超甜型玉米京科甜 183 由北京市农林科学 院选育。菌 株 有 EHA105、pMOG410、gus （ intron） 和 npt-Ⅱ。 PMOG410 质粒构建图见图 1，由辽宁省植物生物技术重点实 验室提供。菌株采用 LB 培养基培养，胚芽注射采用微量注 射器（ 1 ml） 。 1． 2 玉米受体的制备与菌株的培养 取 2 000 粒玉米种 子，萌发后筛选不同长度的胚芽备用。将永久保存的菌种倒
因为转化的盾片不具有分裂分化并形成植株的能力，所 以如何提高胚芽生长点的转化率，如何大幅度提高菌种的侵 染能力，以及如何克服由于生长点损伤造成的褐化等问题仍 然是将来研究的方向和目标。 参考文献
［1］胡建广，王子明，李余良，等． 我国甜玉米育种研究概况与发展方向 ［J］． 玉米科学，2004，12（ 1） ： 12 － 15．
作者简介 刘立岩（ 1973 － ） ，女，辽宁铁岭人，高级实验师，硕士，从事 细胞生物学研究。
收稿日期 2011-03-02
图 1 pMOG410 质粒构建 Fig． 1 Plasmid construction of pMOG410
入新配制的 LB 培养基中，在 25 ℃ 、40 r / min 条件下培养 48 h 后划平板保存。从平板中挑取菌株至 LB 培养基中，在 25 ℃ 、60 r / min 条件下培养 8 h 后，每隔 2 h 测 1 次 OD 值。当 OD 值为 0． 4 ～ 1． 0 时，分别以不同 OD 值的菌株对胚芽进行 浸染，找出浸染率最高的 OD 值。 1． 3 gus 基因的转化 将制备好的玉米胚的受体按胚芽长 度分为 2、3、4、5 mm 4 个不同梯度，用高压灭菌后的微量注 射器吸取处于对数生长期的菌液，将菌液沿胚芽的顶端注射 至胚芽鞘的空腔中（ 胚芽生长点附近见图 2） ，缓缓抽出注射 器。对所有胚的受体逐一注射后，置于潮湿的环境下，于 24 ℃ 培养室中共培养 3 d，找出染色最佳的胚芽长度。利用玉 米胚受体最佳胚芽长度，置于同等条件下共培养 2 ～ 5 d，找 出最佳的共培养天数。 1． 4 gus 基因瞬时表达检测 分别取出共培养 2、3、4、5 d 的 gus 基因转化体，用无菌刀片将胚芽以横纵 2 种方式切开， 浸于固定液中，室温下轻摇 1 h，取出转化体，用磷酸钠缓冲 液漂洗 3 ～ 4 次，将转化体浸没于 X-Gluc 染色液中，在 30 ℃ 的恒温培养箱中染色 6 ～ 12 h。取出染色后的胚芽，用 70% 乙醇脱色 10 ～ 30 min，反复脱色 2 ～ 3 次，直至脱为白色。在 实体解剖镜下，对胚芽的横纵切面进行观察，检测具有蓝色
Research of gus Gene Transformation Transient Expression on Microneedle Injection Sweet Corn（ Z． mays L． ） Germ LIU Li-yan （ Tieling Normal College，Tieling，Liaoning 112000） Abstract ［Objective］The aim to study the gus gene transformation transient expression on microneedle injection sweet corn germ，to lay basis for deeply researching corn transformation． ［Method］The experiment was done by using gus gene transient expression technology mediated by agrobacterium，and a embryo injection system for open gene transformation was built． ［Result］The results showed that the seeds germ with the length of 3 mm was the most optimal transformation receptor． The optimal OD value of EHA105 agrobacterium of bacterial concentration was 0． 558 － 0． 630． The optimal days of co-culture in gus gene transformation was 3 days． Under the optimal conditions，the microneedle injection of germ growth point gene conversion rate was 1% ． ［Conclusion］The study can provide reference for improving the hereditary character and cultivating new varieties of genetically engineering of sweet corn． Key words Sweet corn； Microneedle； Injection； Germ； Gene transformation； Transient expression