质粒的瞬时表达与稳定表达

转染注意因素有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。

在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。

但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。

阳离子脂质体和DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。

大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。

对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。

对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。

培养基中的抗生素抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。

这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这降低了细胞的活性，导致转染效率低。

所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

这样，在转染前也不必润洗细胞。

对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。

另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。

细胞维护和培养的演变可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。

每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。

不要使细胞保持融合超过24小时。

大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。

细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。

这会导致和转染相关的细胞行为的变化。

如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。

瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染：外源⽚段的表达时间短暂。

这主要是因为外源导⼊的裸露的载体整合⼊基因组的⼏率⾮常低，所以以染⾊体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂⽽⼀同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。

⽽且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极⾼。

这就导致瞬时转染呈现⼀个⾼拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且⽆法在这个系统上实现可诱导表达。

稳定转染：是相对瞬时转染⽽⾔，进⼊细胞的质粒整合⼊细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。

在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。

稳定转染并不是⼀种与瞬时转染不同的⽅法，只是对瞬时转染的细胞进⾏筛选，得到稳定整合的细胞株。

稳定整合的⼏率因基因传递的⽅法⽽异，跨度可以从10-8到10-1。

因此，对于有的转染⽅法，⽐如化学试剂介导的转染，其整合⼏乎可以忽略不计。

质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递⽅法，呈现不同的靶向倾向性，所以是⼀种半随机整合。

玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化玉米是全世界最重要的粮食作物之一，也是许多国家的重要原料供应者，尤其是用于生产生物燃料和化工原料。

玉米叶肉细胞是进行基因表达和生物合成的重要细胞类型之一。

由于其高效的生物合成能力和丰富的蛋白质含量，玉米叶肉细胞已成为研究和生产的理想模型。

然而，传统的转染方法对基因的转导效率和表达量有一定局限性，限制了基因表达的研究和应用。

因此，发展一种高效、简便的玉米叶肉原生质体瞬时表达系统具有重要意义。

原生质体瞬时表达系统是在细胞质中直接转导外源基因并进行表达的一种方法。

相比于传统的转染技术，原生质体瞬时表达系统具有以下优势：(1) 相对较高的转导效率和表达量；(2) 无需耗时的细胞培养和稳定转化；(3) 更适用于高通量筛选和表达优化。

因此，建立一个高效的原生质体瞬时表达系统对于基因的功能研究和工业应用具有重要的意义。

在玉米叶肉细胞中，瞬时表达系统的关键步骤主要包括DNA导入、转导、表达和鉴定。

首先，合适的质粒载体和表达载体需要进行构建和优化。

质粒载体应包含适当的启动子、启动子增强子和终止子序列，以确保基因在转导后的高效表达。

此外，选择合适的选择标记基因，如绿色荧光蛋白（GFP）等，以便对转导效率和表达量进行评估。

其次，选择合适的转导方法。

在玉米叶肉细胞中，常用的转导方法包括基因枪转导、电转导和化学转导等。

不同的方法适用于不同的目的和实验条件，因此需要根据具体实验目的进行选择。

例如，基因枪转导适用于高通量筛选，电转导适用于较小规模的实验室研究。

为了提高转导效率，可以优化转导条件，包括DNA浓度、转导时间和转导介质等。

第三，对转导后的基因表达进行鉴定和分析。

通过荧光显微镜观察转导后的细胞在表达载体中是否产生荧光信号，以评估转导的效果。

此外，可以利用Western blotting、RT-PCR等技术对蛋白质和RNA进行定量分析。

然而，在建立和优化玉米叶肉原生质体瞬时表达系统时，仍然存在一些挑战和难题。

L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。

B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C将AB两管混合，放置20min。

3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1中板。

贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。

2转染。

A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。

B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C将AB两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。

***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。

Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。

稳定转染VS瞬时转染展开全文生物通报道：转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程，是细胞和分子生物学研究的重要工具，可用于研究基因表达对细胞生理水平的影响。

不论是质粒、DNA还是各种RNA（mRNA、siRNA或microRNA），要将这些外源核酸转入细胞并不容易，它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。

转染方法可分为物理转染和化学转染，物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等，化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx或基于阳离子脂质的转染试剂。

上述方法都可以解决转染面临的主要挑战，即让带负电荷的核酸分子穿过带负电的细胞膜。

物理转染方法一般是在细胞膜上打洞来克服静电排斥，使核酸插入。

而化学转染中，一般是利用带正电的转染试剂将带负电的核酸包裹起来。

这些方法都可以实现转染，可谓条条大路通罗马，那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢？瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制。

细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止我们如何区分细胞是否转染成功了呢？在转染质粒中往往都含有一个报告基因，来指示细胞中目标基因是否存在，这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。

稳定转染可以在瞬时转染的基础上建立，只不过需要一个重要的偶发过程：在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。

外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。

稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。

在建立上述稳定转染细胞系时，我们需要使用选择性标记来区分瞬时转染与稳定转染。

将这些选择性标记与基因共表达，我们就可以筛选出外源基因已成功整合到基因组的细胞，同时剔除瞬时转染的细胞。

将外源基因与抗生素抗性基因共转染（如新霉素抗性基因neo）是一种常用方法，随后可用相应抗生素（如geneticin或G418）对转染后的细胞进行筛选。

Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。

已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。

特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。

下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。

细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。

对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。

保温时间过长会降低活性。

）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。

如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。

在室温保温20分钟。

细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。

在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。

细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。

质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。

瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。

因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。

判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。

稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。

瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。

瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。

相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。

目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。

细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。

瞬时表达和稳定表达的定义和区别
瞬时转染：转染的核酸不整合到染⾊体上，结果是短暂的⾼⽔平的表达，可以在24-96⼩时内检测表达效果，表达⽔平与位置⽆关，不会受到周围染⾊体元件的影响。

瞬时表达分析所需要的⼈⼒和时间⽐稳定表达都少，但由于DNA的摄⼊效率和和表达⽔平在不同试验中差异较⼤，不长久也不稳定。

超螺旋质粒转染时更倾向于瞬时转染。

瞬时表达为基因-蛋⽩质研究提供了⼀重快速，⽅便的⽅法。

瞬时表达得到的蛋⽩质保存时间⽐较短。

稳定转染：转染的核酸和染⾊体整合到⼀起，但整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

可以通过G418来筛选。

Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。

已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。

特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。

下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。

细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。

对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。

保温时间过长会降低活性。

）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。

如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。

在室温保温20分钟。

质粒转染的原理(2011-10-2212:32:05)转载▼标签：转染科研教育分类：细胞/动物转染DEAE-葡聚糖（Diethylaminoethyl(DEAE)-dextran）：这个早在1965年出现的转染方法差不多是最古董级的方法之一了，直到现在竟然还有少数人坚持采用。

带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。

通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用，使得DNA复合体进入细胞。

DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。

磷酸钙共沉淀转染：最早是在1973年开始采用的。

氯化钙＋DNA＋磷酸缓冲液按一定的比例混合，形成的极微小的磷酸钙-DNA复合物沉淀粘附到细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。

沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值，钙离子浓度，DNA浓度，沉淀反应时间，细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，重复性不佳。

现在还会操作这种古董级方法的人怕已经不多啦。

比起DEAE法这个更容易得到稳定转染，但是转原代细胞比较困难的。

电穿孔法：通过短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。

DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内。

电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。

理论上说电穿孔法可用于各种细胞，而且不需要另外采购特殊试剂。

可是需要昂贵的设备——这个一次性投资可不便宜，而且每次转染需要更多的细胞和DNA——因为细胞死亡率高，所以每种细胞电转的条件都需要优化，才能达到最佳效果。

现在，由于电转染技术的革新以及新型电转染仪的面世，电穿孔法的应用也越来越普遍。

脂质体：中性脂质(lipid)是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。

带正电阳离子脂质体(Cationic liposomes)则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，据认为一个约5kb 的质粒会结合2-4个阳离子脂质体，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入培养的细胞。

生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体（McAb）、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇（PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性:相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性:质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等）第二章基因工程制药蛋白类药物的特点:结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择;给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）;药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题:药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2）基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段:培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶（切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5'粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列.在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA.♦酶切反应的温度♦DNA的分子结构♦反应缓冲液组成♦反应时间、反应体积等➢工具酶✦核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。

稳定表达系统和瞬间表达系统的区别稳定表达系统和瞬间表达系统是按目的蛋白表达的时空差异来分的；瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而丢失，目的蛋白的表达时限短暂。

瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。

大规模的瞬时表达技术是近年来的一个研究热点。

已有报道能放大到100L反应器中生产重组蛋白，产量可达1~10mg/L。

缺点是该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等，而且瞬时转染得到的蛋白质产物保存时间较短，只能持续数天或2周。

这是因为瞬时转染中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不与基因组染色体相整合，当细胞复制后，诱导的性状消失。

稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，目的蛋白的表达持久、稳定。

缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。

有研究表明：把目的基因定点整合入染色体高活性位点有望能在较短时间内获得高表达细胞株。

另外，近年来还报道了一些筛选高表达克隆的新方法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实验时间甚有帮助。

CHO细胞的背景资料CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。

全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。

另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。

CHO细胞的培养基类型：1. 血清培养传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。

影响细胞转染成败的原因分析转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。

1、载体DNA总则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。

确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。

在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。

·载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。

转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。

·载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。

制备产物中残余的污染物(如CsCl，内毒素)可能会影响转染效率。

·载体构造(启动子/增强子/ORI)——转染体系通常用带有强病毒调节元件(如，RSV，CMV，和SV40)的对照载体进行优化和比较。

然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。

例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达large T抗原(如，COS)；而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。

除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。

2、细胞·贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。

相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

·分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。

因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。

同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态；此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。

比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。

如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。

很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。

每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。

即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。

试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。

其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。

DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。

几天内，大部分外源DNA 会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。

因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。

瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。

超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。

瞬时表达适合研究启动子等调控元件——不过，诱导型的启动子除外。

稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。