基因枪法转化小麦幼胚瞬时表达

基因枪介导的转Ｖｐ－１基因小麦的获得及检测作者：杨晨，黄涛来源：《湖北农业科学》 2014年第2期杨晨ａ，ｂ，黄涛ａ，ｃ（华中农业大学，ａ．麦类作物分子生物技术实验室；ｂ．生命科学技术学院；ｃ．植物科学技术学院，武汉４３００７０）摘要：为了探究源于玉米的抗穗发芽基因Ｖｐ－１改良小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）抗穗发芽性状的可行性，以ｐｍｉ及ｂａｒ为筛选标记基因，通过基因枪介导法将Ｖｐ－１基因导入小麦栽培品种郑麦９０２３幼胚愈伤组织中，用甘露糖和双丙氨磷（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）２种不同的筛选剂筛选得到抗性植株并对其进行ＰＣＲ鉴定。

结果显示，通过ｐｍｉ／甘露糖筛选体系得到５３株抗性植株，其中５株为转基因小麦植株，转化率为０．２９％；通过ｂａｒ／Ｂｉａｌａｐｈｏｓ筛选体系得到１５２株抗性植株，其中１１株为转基因小麦植株，转化率为０．７８％。

关键词：小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）；基因枪转化；Ｖｐ－１基因；ｐｍｉ基因；ｂａｒ基因中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｑ７８１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）02－0265-03小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）穗发芽（Ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）是指小麦在收获前遇到阴雨或在潮湿环境下的穗上发芽现象，是一种世界性的自然灾害［１］。

Ｖｐ－１（Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ－１）是玉米体内控制穗发芽的重要调节基因，该基因编码种子特异性转录因子，通过影响植物脱落酸ＡＢＡ信号的传导促进与胚成熟相关基因Ｅｍ的表达，抑制α－淀粉酶活性，从而对种子休眠和发芽起着重要的调控作用［２］。

小麦中存在Ｖｐ－１基因的同源序列ＴａＶｐ－１，但ＴａＶｐ－１不能正确拼接，导致大部分成熟ｍＲＮＡ不能编码全长ＶＰ－１蛋白质，从而失去调节功能［３］。

将有功能的Ｖｐ－１基因导入到小麦中表达，可能会增强小麦的穗发芽抗性。

自１９９２年Ｖａｓｉｌ等［４］首次成功地将ｇｕｓ和ｂａｒ基因通过基因枪法导入胚性愈伤组织，获得第一株转基因小麦以来，小麦的遗传转化已取得较大的突破［５－７］。

HEREDITAS (Beijing) 2011年5月, 33(5): 422―430 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期: 2010−10−09; 修回日期: 2010−12−04基金项目:国家重大科技专项(编号：2008ZX08010-004)资助作者简介:叶兴国, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方向: 小麦生物技术育种。

E-mail: yexg@网络出版时间: 2011-04-02 17:53:03URL: /kcms/detail/11.1913.R.20110402.1753.005.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00422小麦转基因方法及其评述叶兴国, 陈明, 杜丽璞, 徐惠君中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081摘要: 小麦是遗传转化比较困难的作物之一。

为了克服小麦基因工程育种和功能基因组学研究的障碍, 人们分别尝试利用基因枪、花粉管通道、超声波、离子束注入、激光微束穿刺、PEG(Polyethylene glycol)、电击和农杆菌等方法转化小麦, 涉及的受体材料包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织、幼穗、芽尖和花器官。

文章对小麦主要遗传转化方法及其应用进行了介绍、回顾和评述, 分析、比较了获得安全型转基因小麦的几种策略, 以期增强读者对小麦转基因技术和进展的了解, 促进小麦转化技术的持续改进和提高。

关键词: 小麦; 遗传转化Description and evaluation of transformation approaches used in wheatYE Xing-Guo, CHEN Ming, DU Li-Pu, XU Hui-JunInstitute of Crop Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081, ChinaAbstract: Genetic transformation is a valuable tool for direct crop improvement and functional genomics study. Unfortu-nately, wheat is considered as a recalcitrant plant to genetic transformation due to its low efficiency and genotype depend-ency. To overcome these problems, various transformation methods such as biolistic bombardment, Agrobacterium tumefa-ciens , pollen-tube pathway, ion implantation, laser microbeams puncture, treatment with polyethylene glycol and ultrasonic wave, and electroporation have been reported in wheat using various types of explants including immature embryos, mature embryos, anthers derived calluses, inflorescences, apical meristems, and other floral organs. In this review, several major transformation approaches and their applications in wheat are reviewed, and potential strategies for the development of safe transgenic wheat plants are discussed. The objective of this review is to provide an update on current status of wheat trans-formation, and to stimulate further research for improving transformation efficiency in wheat.Keywords: wheat; genetic transformation小麦是世界上重要的粮食作物之一, 与社会经济发展、粮食安全供给和人类营养健康密切相关。

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13(5):686~687*基金项目：国家转基因植物研究与产业化开发专项(No.jy03-B-23-02)和陕西省科技攻关项目(No.2003K03-G1-04)资助。

吕瑞华:女，1982年生，硕士研究生。

**Author for correspondence.通讯作者。

E-mail:<chenyf3828@>.收稿日期：2004-07-30接受日期：2004-09-20·研究简报·基因枪法转化小麦幼胚瞬时表达*吕瑞华曹团武陈耀锋**李春莲任慧莉郭月霞曹欣赵云祥(西北农林科技大学农学院,国家小麦改良中心杨陵分中心,杨陵712100)关键词:基因枪;小麦幼胚;基因;瞬时表达;转化效率GUS Transient Expression of Wheat Immature EmbryoTransformated by Particle BombardmentL Rui-Hua CAO Tuan-Wu CHEN Yao-Feng**LI Chun-Lian REN Hui-LiGUO Yue-Xia CAO Xin ZHAOYun-Xiangparticle bombardment;immature embryos of wheat;gene;transient expression;transformation efficiency自Vasil等(1996)利用基因枪将获得小麦对除草剂Basta 具有抗性的再生植株以来，基因枪介导的小麦遗传转化研究发展很快(Altpeter.,1996)。

在小麦基因枪转化中,优化基因枪转化因素,提高转化效率仍然是基因转化的关键问题。

实验研究了不同金粉用量、质粒DNA浓度及轰击枪数对小麦幼胚瞬时表达的影响,通过GUS染色和细胞压片,分析了基因的瞬间表达。

基因枪转化法基因枪转化法是借助氦气等动力将用金粉或钨粉颗粒包裹的外源基因射入植物细胞，使外源DNA 整合到受体细胞中，从而实现对受体细胞的转化的物理方法。

目前基因枪转化法使用的是Bio-Rad公司的PDS-1000/He 基因枪转化系统。

一、基本原理以压缩气体（氦或氮）转换成的气体冲击波为动力，使基因枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室，将包裹着DNA 的金属颗粒射入受体组织，穿透受体组织的2～3 层细胞，然后通过组织培养技术再生出植株，经检测整合有目的DNA 的再生植株即为转基因植株。

基因枪转化法适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。

1.基因枪转化技术的优点（1）受体材料来源广泛，不受物种和植物基因型的限制，能转化植物的任何组织或细胞，特别是农杆菌侵染不敏感的单子叶植物，提高了禾谷类植物的转化效率。

（2）基因枪法克服了采用其他转化方法时外源DNA 进入细胞质后很难穿过双层膜进入细胞器的难题，用基因枪技术转化这类细胞器，转化频率高，重复性好，是目前该领域研究中最常用和最有效的DNA导入技术。

（3）基因枪法可控程度高，方法简便易行，外源基因可以构建于表达载体中，也可以是最小表达框。

2.基因枪技术的缺点（1）转化效率不高。

（2）外源基因往往是多拷贝随机插入，在转基因植物中存在多种方式的重排。

（3）由于多拷贝插入转基因，植株易发生转录或转录后水平的基因沉默。

（4）实验成本高。

二、转化方法基因枪转化法是将外源DNA直接导入受体细胞的物理方法，包含四部分内容：1.受体材料的预处理在基因枪轰击前先将受体材料在含有0.5 mol/L山梨醇和0.5 mol/L甘露醇的高渗培养基处理4～6 h。

2.微弹DNA的制备钨粉的制备：称取60 mg的钨粉放在1.5 mL的离心管中，加入1 mL 70%乙醇，在涡旋振荡器上振荡15 min，然后10000 r/min 离心3 min，仔细去掉上清液，再加入70%乙醇重复上述步骤一次。

文章编号:1005-2690(2019)08-0155-01中图分类号:S512.1文献标志码:B基因枪介导抗逆相关基因转化小麦的研究陈佳琦，董礼，樊悦，王妮（河北农业大学，河北保定071000）摘要:目前，植物结构培养技术、DNA 体外重组等技术已经被应用于农作物育种。

破生殖隔离这项转基因技术可以利用基因库创建新的条件，同时还能提供新的创造变异技术门径。

基于此，分析并研究相关技术，以期为广大研究者提供参考借鉴。

关键词:基因枪；抗逆性；基因转化；小麦目前小麦的转化方法丰富多样，但小麦的转化效率并不乐观，现阶段基因枪法以及农杆菌介导法是小麦遗传转化运用最普遍的技术方法，其使用率分别是68.8%、15.9%。

还有一个是花粉管通道法，其方法占有比例是15.3%[1]。

基因枪法的受体比较宽阔，尤其是粒子射出的速度和射入受体细胞的深度，该项操作使得工作人员可以精确对其进行控制，由此可知基因枪法在小麦的遗传转化中作用是非常大的。

1基因枪法的介绍世界第1例转基因小麦是在1992年Vasil 和他的伙伴利用基因枪法得到的。

Vasil 与其伙伴又对Pavon、Bobwhite、RH7700193个不同品种的胚（该胚还处在幼嫩阶段）以及愈伤组织为外植体，用基因枪法成功获得了转基因株。

基因枪的转化效率主要来自受体的自身系统因素和基因枪转化系统的外在因素[2]。

2基因枪转化的受体体系以小麦为例，陈梁鸿等人认为幼穗里的愈伤组织状态比较优胜于幼胚里的愈伤组织；而周森平等人的研究里又发现新的要点，其将幼胚盾片作为受体时，植株再生率为0.5%～2.2%，明显低于将幼胚作为受体的再生率。

但是将盾片、幼胚、幼穗作为外植体的时候，又出现新的限制，即受到季节等严苛限制，而且生理期的一致性也没有如期得到保证，采用成熟胚作为外植体时反而能克服上面的限制，相关研究也表明成熟胚同样具有很强的愈伤组织诱导以及再生能力[3]。

表1、表2是两组不同浓度的幼胚愈伤组织出愈率以及胚芽率情况。

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究
逆境是影响植物生长和产量的一个重要因素。

为了提高作物对逆境的适应能力，已经对一些逆境诱导转录因子进行了研究，其中DREB1A是其中一个非常重要的因子，可以增强植物的
耐旱、耐寒和耐盐能力。

而基因枪法是一种常用的转基因方法，它可以用来将外源基因导入植物细胞中。

因此，本文以转基因小麦为研究对象，采用基因枪法来获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦。

首先，需要构建DREB1A基因表达载体。

将DREB1A基因进
行PCR扩增后，酶切后与表达载体连接，形成DREB1A表达
载体。

接下来，利用基因枪将DREB1A表达载体导入小麦愈伤组织
细胞中。

为了提高转化效率，应将该组织预处理，促使其处于最佳的转录活性中。

转基因小麦的筛选需要进行两步，第一步为抗性筛选，将含有抗性基因的感受器小麦筛选出来。

第二步则是检测目标基因的表达情况，以确保目标基因已成功导入转基因小麦中。

通过PCR扩增和Northern印迹等方法，都可以检测目标基因在转
基因小麦中的表达情况。

本研究采用基因枪法获得了DREB1A转基因小麦，然后对其
进行了相关的性状测定。

结果表明，转基因小麦的耐盐、耐寒和耐旱能力都得到了显著提高。

因此，基因枪法获得DREB1A转基因小麦是一种可行的方法，可以促进小麦的逆境适应能力，并提高其产量和质量。

这为生产上的应用提供了新的选择。

几丁质酶(Chitinase)基因转化小麦的研究本研究利用基因枪法、农杆菌法和花粉管通道法，首次将菜豆几丁质酶基因导入春小麦东农7742中，同时对转基因的表达和遗传进行了分析，对转基因植株的抗病性进行了观察。

对影响转化的各种因素和转基因小麦研究中存在的问题提出了自己的见解。

主要研究结果如下： 1.利用PDS1000/He型高压氦气基因枪，以携带菜豆几丁质酶基因的质粒DNA轰击小麦萌动幼胚8139块，在东农7742To代获得经PCR扩增和PCR-Southern杂交证实的转基因小麦植株7株，转基因植株分属4个不同轰击参数的组合，转化率分别为0.56％、0.36％、0.20％和0.35％；利用农杆菌介导法和利用基因枪与农杆菌协同转化法转化东农7742小麦幼胚愈伤，共感染外植体1546块，获得转化愈伤组织的频率分别为0.46％和0.32％，但转化愈伤未能再生植株；利用花粉管通道法将菜豆几丁质酶基因导入小麦东农7742，共操作小花385个，获得2株转化植株，转化率为0.52%；三种转化方法各有特点，对于组织培养再生频率高的基因型适合用基因枪法或农杆菌法，对于组织培养再生性差的基因型适合用花粉管通道法。

2.小麦幼胚愈伤组织胚性化快且质量好，是比幼穗或成熟胚更理想的转化受体。

供试的三个小麦品种因不同基因型，幼胚愈伤组织再生频率差异明显，辽-10为7.84％，91B569为13.68％，东农7742为54.88％。

小麦本身对选择剂卡那霉素有较高的天然抗性，采用G418对小麦幼胚愈伤组织进行筛选效果明显。

G418的毒性作用有滞后特点，三个小麦品种对G418的敏感性依次为辽-10＞91B569＞东农7742。

用G418做选择剂筛选辽-10、91B569和东农7742抗性愈伤的适合浓度分别为25mg/L、30mg/L和35mg/L。

此外，不同轰击参数影响金粉分布的范围和密度，轰击距离比轰击压力影响大。

轰击距离为6或9cm时，内部金粉密度大而外围金粉密度小，差异极大。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 60−67/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08010-004)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 夏兰琴, E-mail: xialq@, Tel: 010-********第一作者联系方式: E-mail: mdh2493@, Tel: 136********Received(收稿日期): 2012-04-19; Accepted(接受日期): 2012-09-05; Published online(网络出版日期): 2012-11-14. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20121114.1645.017.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00060基因枪转化小麦主要轰击参数的优化闵东红1 何 莎1,2 张 彦2 夏兰琴2,*1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京100081摘 要: 基因枪转化是目前小麦遗传转化的主要方法。

影响基因枪转化效率的主要参数有轰击距离、轰击压力、DNA 总量及浓度、金粉颗粒大小及用量等。

为改善目前小麦遗传转化效率偏低的现状, 以普通小麦品种科农199为受体材料, 设金粉大小(0.6 μm 和1.0 μm)、轰击距离(5.5 cm 和8.5 cm)及轰击压力(650、900和1100 psi)三因素共12个处理, 利用pAHC25质粒转化小麦幼胚, 以确定最佳轰击参数, 建立稳定高效的普通小麦基因枪转化体系。

结果表明, 3个因素的不同组合对幼胚的愈伤诱导效率没有明显影响, 但对再生率影响较大, 以金粉0.6 μm 、轰击距离5.5 cm 的再生率最高。

小麦成熟期穗发芽作为一种品质性状和抗逆性状,一直倍受各国育种家的重视。

以往对抗穗发芽育种主要通过两条途径,一是以种皮色泽及一些生理指标为标记进行选择育种。

二是选择早熟品种,避开梅雨季节而防止穗发芽,这样得到的抗性品种,一方面抗性水平有限;另一方面早熟品种则因生育期缩短而影响产量水平。

近年来,许多研究表明α-淀粉酶活性的提高是造成穗发芽的直接原因[1],且控制α-淀粉酶活性的基因已被分离[2,3,4],为小麦抗穗发芽分子育种奠定了基础。

在已分离的抗穗发芽基因基础上,采用气动式基因枪,将抗穗发芽基因与抗除草剂基因导入栽培小麦品种中,通过优化轰击条件,利用优化的再生培养系统,获得再生植株,为解决当前生产中存在的穗发芽问题,提供可利用的种质资源。

1材料和方法1.1材料普通小麦豫麦34、豫麦18-64、温麦6号和济麦1号四个品种为转化起始材料;愈伤组织诱导培养(M S基本培养基+2mg/L 2,4-D+0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8),分化培养基(M S 基本培养基+1.0mg /LZ T+3-5mg /Lbialaphos+0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8),生根培养基(1/2M S 基本培养基+0.2mg /LNAA+1-2mg/L Lbialapho s +0.7%琼脂+3%蔗糖,PH5.8);质粒pBluescript SK+:含种子发芽启动子Gli 及其下游的抗穗发芽基因(Phr-r )插入质粒的多克隆位点(M CS ),另一质粒,将CaM V35S 启动子及位于下游的bar 基因插入其多克隆位点作为筛选标记。

1.2方法剪取开花后12～14d 的幼穗,剥取幼嫩种子,用70%的酒精表面消毒1min ,无菌水冲洗3次,再用0.1%的升汞(Hgcl 2)消毒10min ,无菌水冲洗3～4次,在超净工作台解剖镊剥出幼胚,盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基上,放在直径9cm 培养皿中央2cm 的范围内,用Parafilm 进行封口,25℃暗培养待用。