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第四、五节 基因工程工具酶和克隆载体.ppt (恢复)

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基因工程ppt

基因工程ppt

粘粒载体有更大的容量
cosmid：由质粒与噬菌体 COS 末端组成，可克 隆 29-4组序列的克隆 包装后通过感染途径进入细胞 在细胞内可形成环状质粒，并作为质粒复制
缺陷： 外源 DNA 不稳定，易发生重排并丢失 插入片段长度对扩增效率影响极大
RNase H DNA polymerase
目前常用的逆转录酶 RNase H 均缺失 逆转录酶需要引物，一般用 Oligo-dT
五、末端脱氧核苷酸转移酶
Terminal deoxynucleotidyl transferase 催化脱氧核糖核苷酸依次添加到 DNA 3,羟基端 聚合反应没有特异性，无需模板 用途：
常用λ噬菌体有哪些种类？
EMBL 3：置换型载体 克隆片段长度：7－22 kb Spi 筛选，野生型在含 P2 噬菌体的宿主中受限
λgt 10：插入型载体， 克隆片段长度： 0－7.6 kb 片段 CI 筛选，野生型载体易进入溶源生长状态
λgt 11：插入型载体 克隆片段长度： 0－7.2 kb 片段 LacZ基因插入失活
一、什么是质粒载体？
质粒(Plasmid) 细菌染色体外的遗传单位 小分子环状 DNA
具有自身的复制起点 具有抗药性基因 人工构建的多克隆位点
复制子决定了质粒拷贝数
复制起点与调节序列共同组成复制子 严紧型复制子：
复制需 pol III，与细菌基因组复制同步 拷贝数：1－5 质粒/细胞 松弛型复制子： 复制需 pol I，独立复制 拷贝数：10－200 质粒/细胞 Rop 基因突变使质粒达到数千拷贝
一、限制性内切酶是切割 DNA 的工具
Restriction enzyme or restriction endonuclease 细菌产生的酶，能特异性识别 DNA 序列，水解 磷酸二酯键，切开 DNA 双链 它是细菌的一种防御机制

基因工程及其应用【可编辑PPT】

基因工程及其应用【可编辑PPT】

E. coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
当λ(k)噬菌体侵染E. coli B时，由于其DNA中 有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E. coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特 定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲 基化的序列。
基因重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或 新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
供体、受体和载体是重组DNA技术的三大基本元件。
基因工程的目的：
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种
反应必须ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特异性识别部位 并切割。 如EcoR I、Hinf III III 型限制酶的基本特点：
可以识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端2426bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
2、限制性核酸内切酶的命名原则
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一 个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、 二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
⑶核酸内切限制酶对生物基因组的消化作用
小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的片 断）cheria coli RY13的第一个限制
酶。
3、限制性内切酶作用后的断裂方式
形成粘性末端； 形成平末端；
粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2 个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之 间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。

Tan第二章-基因工程的工具酶PPT课件培训资料.ppt

Tan第二章-基因工程的工具酶PPT课件培训资料.ppt
All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity.
..分割..
Slide 5
• 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分 离出两个类内切酶，Hind II和Hind III， 为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II 类酶，搞清识别位点的有300种，商品化 的约有100种，而实验室常用的有20种 。
..分割..
变的。如：BseJ I GATNNNNATC
• Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的
识别序列之中。如：Ehe I GGCGCC
•
Hin6I GC GC
..分割..
Slide 18
2.1.4 限制性内切酶的切割位点
• 切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下， 两条链断开的位置。
• 一般在识别序列的内部或两侧附近。 • 以或 表示。 • 环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，
..分割..
Slide 23
2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系
2.1.6.1 底物DNA 2.1.6.2 酶量 2.1.6.3 反应缓冲液 2.1.6.4 反应温度
..分割..
Slide 24
2.1.6.1 底物DNA
进行大量酶切时，先要确定
RE 的浓度。一般 1U RE 于
37 ℃条件下作用底物 DNA

基因工程的工具ppt课件

基因工程的工具ppt课件
基因工程
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”， 对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内 进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人 类所需要的新的生物类型和生物产品。
基础理论 和技术的发展 催生了基因工程
DNA重组技术的基本工具
③分类：E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
二者在性质 上的区别
基因的针线——DNA连接酶
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即 把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯键)， 这样一个重组的DNA分子就形成了。
（3）运载体
为什么 要具备 这些条件
①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件： 能在宿主细胞内复制，并稳定地保存有多 个限制酶切点，与外源基因连接。 具有某些标记基因，便于进行筛选 对受体细胞无害 ③举例：质粒（常用）、噬菌体和动植物 病毒
到哪里去寻找这种酶
基因的针线（分子缝合针） ——DNA连接酶
基因的运输工具（分子运输车） ——运载体
（1）限制酶
与我们学过的 DNA酶相同吗？
①分布：主要在原核生物中。
作用是什么
②作用特点:专一性，识别特定核苷酸序列，
切割特定切点。
切断的是什么键
识别序列的特点
③结果：产生黏性未端和平末端
两者的区别答案：（1）从基因中获取 化学合成（人工合成）（2）限 制性核酸内切酶（限制酶） DNA连接酶（连接酶） （3）质粒 小型环状（双链环状、环状） （4）低 筛选 （5）氨基酸
练习
6）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。 在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步

第二章基因工程载体和工具酶

第二章基因工程载体和工具酶

溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因
cos
阻遏基因 早期控制基因
阻遏基因 重组基因
删除与整合基因
l - DNA
头部合成基因 尾部合成基因
COS 3’ 5’ TCCAGCGGCGGGG
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CCCGCCGCT 3’ COS
第二章基因工程载体和工具酶
λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
Plasmid plink 322
l 在pBR322基础上改建，增加了一个多接头 （polylinker），即增加了多克隆位点。
l 全长 3.8 kb
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第二章基因工程载体和工具酶
Plasmid plink 322
PPT文档演模板
第二章基因工程载体和工具酶
pUC 质粒(University of California)
第二章基因工程载体和 工具酶
PPT文档演模板
2020/12/10
第二章基因工程载体和工具酶
本章目录
l 2.1 载体 l 2.1.1 质粒载体 l 2.1.2 噬菌体载体 l 2.1.3 其他载体
l 2.2 工具酶 l 2.2.1 限制性核酸内切酶 l 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 l 2.2.3 DNA连接酶 l 2.2.4 碱性磷酸酶 l 2.2.5 末端脱氧核苷酸转移酶
噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状 l Λ基因组三个区域：
左侧：包括外壳蛋白基因，20kb 中间区：18kb 右侧：复制及裂解基因，12kb
λDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片
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第二章基因工程载体和工具酶

工具酶和基因载体PPT课件

工具酶和基因载体PPT课件

P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
DNA连接酶的基本性质
连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37℃。但 在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不 稳定的。
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
Klenow
dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
Klenow酶的基本用途：
补平由限制性内切酶切割DNA产生的3’凹端 用P32 dNTP补平3’凹端 对带3’突出端DNA进行末端标记 cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA 应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序
1.补平由核酸内切酶产生的3’凹端
5‘ … G-C-T-G-OH
② 5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行 32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多 聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘 性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
5’-GGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-CCTAGA-5’

何水林版基因工程第二章基因克隆的工具酶幻灯片


Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
1 限制性核酸内切酶(restriction enzyme)
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978
Werner Arber
Daniel
Hamilton O.
Switzerland
Nathans
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
1.3 限制性核酸内切酶的命名
属名
种名 株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
H i n d III Hind III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
restriction enzyme
一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断 双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖 核酸酶（DNase），它们的切点大多很严格，要求专 一的核苷酸顺序─识别顺序。
限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析 和基因工程的研究开辟了途径。
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
在Ecoli.K上生长的λ噬体则 表示为λ（K）。 实验表明，用这种λ（K） 噬菌体感染Ecoli. B，形成 噬菌斑的效率就很低 因此λ（K）噬菌体受到了 B菌体的限制。
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶
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5’→3’的DNA聚合酶活性 5’→3’的核酸外切酶活性 3’→5’的核酸外切酶活性
用途：黏末端变为平末端；缺口前移标记法
大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段 （ Klenow ）
大肠杆菌DNA聚合酶II经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端 三分之二的大肽段，即为Klenow酶； Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸 外切酶活性，但失去了5‘→3‘核酸外切酶活性
如果在细菌中没有发现ER，现代生物学和重
组DNA就不可能发展起来。
I型限制性内切酶
复杂的核酸酶，Eco K，Eco B 具有内切酶和甲基化酶活性，需要ATP和Mg2+，SAM （甲基化酶/ S-腺苷蛋氨酸）作为辅助因子 有3个亚单位的多功能酶：限制性亚单位，修饰性亚 单位和专一性亚单位 识别位点位15个bp， 不能作用于含有甲基化腺嘌呤识别序列的DNA分子 具有高ATPase酶活性，每切割一个磷酸脂键消耗 10000个ATP分子 具有专一识别位点和非专一的切割位点（片断大小不 一，不利于基因操作） 如：Eco K 5’-AACNNNNNNNNGTGC-3’ 3’-TTGnnnnnnnnCACG-5’
酶的活性
1个活性单位：在适当的反应条件下 (包括温度、pH和离子强度等)，1h 内在 50μl容积中完全酶解1ug特定DNA底物(通常 用λDNA)所需要的酶量。
星号活力
在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类 似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示，如 EcoRⅠ*。因此,只有在相当特殊的条件下，酶活才与发 表的结果相符。必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐 的反应条件。 反应条件的改变如pH值升高、NaCl浓度降低、Mn2+取 代Mg2+以及DNA的甲基化影响。例如EcoRI正常的识别 位点为CAATTC，改变条件后可以变为AATT，因此推 荐使用酶相应的缓冲液
III型制性内切酶
两个不同的亚单位，一个负责识别和修饰，另 一个负责核酸酶反应； 需要ATP和Mg2+ 识别位点非对称，切割序列不具有回文结构， 通常在识别位点下游25-27bp处切开一个切口， 接着在反方向上切开两个位点，打断DNA双链。 如 Hga I 识别位点为5’-GACGC(N)5-3’ 3’-CTGCG(N)10-5’ 它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备 实用价值。
affecting factors
Temperature：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值 在15℃以下，然而保持连接酶活性的最适温度却是 37℃, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最 适温度的折衷。经常采用12.5℃（4-15℃） DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓 度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体
同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切 割同一靶序列 同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生 相同粘性末端的酶。 远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切割位置不一 致 可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的 Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列 之中
time：O/N better
DNA聚合酶
依赖于DNA的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ(全酶)、
DNA聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)、耐热DNA聚合
酶(Taq 酶)。 依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶
不依赖于DNA的DNA聚合酶：末端转移酶
大肠杆菌DNA聚合酶I（ DNA pol I ）
按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶
按作用位点分：内切或外切酶 5‘-核酸酶或3’-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseA、 RNaseT1、DNaseⅠ、• 切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体、外切核酸酶等。 外 许多核酸酶兼有内切和外切活性
核酸酶的分类
辅助因子
E. Coli DNA 连接酶 T4 DNA连接 酶
连接双链DNA 分子和单链相 NAD+ 邻核苷酸之间 的切口 ATP
黏末端接口
黏末端接口和平末 端接口
Ligation of DNA fragments in vivo and in vitro
in vivo（体内）：不仅形成重组分子的效率低,而且 还可能伴随着末端核苷酸的缺失。 in vitro （体外）：减小了DNA进入细胞后遭受降 解危险；粘性末端体外连接将保护原来识别序列的 完整可以控制连接时的反应条件
碱性磷酸酶
来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP） 催化去除DNA末端的5’磷酸集团，从而修饰DNA末端 该酶可以阻止已经切割的环化分子的再环化或质粒二聚体的形成
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶， 随机掺入dNTPs
前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称
符号,名称最后部分往往包含罗马数字, 表示在该特殊菌株中
发现这种酶的先后次序。
识别位点
cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5’-phosphate and a 3’-OH. They leave blunt ends,or protruding 5’- or 3’termini. 如EcoRⅠ: ↓ *
用途：
补平由核酸内切酶产生的5‘黏末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列
T4-DNA聚合酶
基本特性：
在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性
内切酶ห้องสมุดไป่ตู้
──非专一性──
外切酶 ─3＇-核酸酶 核酸酶─ ──RNA─ 外切酶 ─专一性─ 非限制性 内切酶─
─5＇-核酸酶
── 内切酶─
限制性 ──DNA─ ──外切酶
单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）
大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+
5’
3’
5’
3’
双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）
大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切
5’ 5’ 3’ 3’
双链核酸外切酶：λ 核酸外切酶（λExo）
λ核酸外切酶特异性地从5‘ 端外切
5’ 3’
单链核酸内切酶：S1核酸酶
S1核酸酶的基本特性： 来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） Zn2+必需 最适pH范围为4.0 -- 4.3 需要NaCl 10 -- 300 mM 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 S1核酸酶的基本反应:
T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）
TT4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸基团
核酸修饰酶
激酶
T4噬菌体多核苷酸激酶具有5‘磷酸化和去磷酸化酶双重活性。 两种用途： 是的ATP的γ-32P转移到脱磷酸DNA的5’； 磷酸交换反应，使磷酸化DNA的5’磷酸转移到过量的ADP上，再使 DNA重新被ATP的γ-32P磷酸化。 该酶用于DNA末端标记，接头合成以及5’末端磷酸化反应
内切单链DNA或RNA 5‘ dMPs 或5‘ NMPs 内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA
S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）
单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶
基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A..espejiana） 基本用途：诱发DNA突变
酶的命名
derivation：first three names from the latin names of the
microorganism that produces them. first letter(genus),next two letters(species)
writing：
化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括
蛋白质和核酸等。
一、用于基因克隆的酶
限制性核酸内切酶（ER） DNA连接酶
DNA聚合酶:Klenow酶、Taq酶、反 转录酶、末端转移酶 碱性磷酸酶
多核苷酸激酶 核酸酶
限制性内切酶
1970之前不知道如何切割DNA，直到人们发现细 菌的限制和修饰系统：限制是指细胞（如细菌） 能识别外来的DNA并把它切成片断；修饰是指细 胞通过对内源DNA某些碱基的甲基化起到保护内 源DNA的作用而使之不会被切割。
5＇G A A T T C 3＇
3＇C T T A A G 5＇
一些酶具有相同识别位点，但切割位点不同 如Sma I 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC -3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG -5’ Xma I 5’-CCCGGG-3’ 5’ -C -3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGGCC -5’ 许多酶识别位点不同，但切割位点相同，可产生相同的黏末端 如 BamH I 5’-GGATCC-3’ 5’-GGATC -3’ 3’-CCTAGG-5’ 3’-C -5’ Bgl II 5’-AGATCT-3’ 5’-AGATC -3’ 3’-TCTAGA-5’ 3’-T -5’ II型酶切位点的数量与基因组大小、碱基组成以及识别区的GC 含量有关。从统计学上将4碱基位点平均应该256个bp一个位点， 6碱基为4096bp 利用限制性内切酶可以建立DNA片断的酶切位点物理图谱