第二章 基因工程工具酶

第二章 基因工程工具酶
• 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。 • 这些酶类参与微生物的核酸代谢 ， 在核酸复制和 这些酶类参与微生物的核酸代谢， 修复等反应中具有重要作用， 修复等反应中具有重要作用 ， 有的酶还作为微生 物区别自己和非己的DNA进而降解非己 进而降解非己DNA的防 物区别自己和非己的 进而降解非己 的防 御工具。 御工具。 • 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操 作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。
识别序列
• 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。
A B C C’ B’ A’ 或 A’ B’ C’ C B A
A B N A’ B’ N’
B’ A’ 或 B A
A B A B
B’ A’ B’ A’
• 回文结构（palindrome）：序列正读和反读 是一样的，即有一个中心对称轴，从这个 轴朝两个方向读序列是完全一样的。 • 在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用 下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致 链的断裂。
识别序列
TGAN8TGCT AACN6GTGC
旋转对称序列
距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下 切割位点 随机性切割 特异性切割 游24-26bp处
二、限制性内切酶作用机制 限制性内切酶以双链DNA为底物，识 别特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷 酸二酯链，产生具有3’-OH和5’-P的DNA片 段。
BamH I 5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’ Bgl II 5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’
5’ XXXXG
GATCCXXXXXX 3’ GXXXXXX 5’
5’ XXXXA
GATCTXXXXXX 3’ AXXXXXX 5’
四、限制性内切酶切割DNA的位点 限制性内切酶切割 的位点
限制性内切酶切断DNA链上磷酸二酯键的位置一般 在识别序列内部，如G↓GATCC, AT↓CGAT; 也有少数在识别序列的两端,如↓GATC, CATG ↓。 环状DNA分子上，若某种限制性内切酶有n个识别序 列，则完全切割后可获得n个片段。线状DNA分子，若 某种限制性内切酶有n个识别序列，则完全切割后可获 得n+1个片段。
限制性核酸内切酶（ 限制酶） 限制性核酸内切酶 （ 限制酶 ） ： 在细 胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷 胞内能够识别双链 分子中的特定核苷 酸序列， 并对DNA分子进行切割的一种酶 。 分子进行切割的一种酶。 酸序列 ， 并对 分子进行切割的一种酶 功能：降解不同源DNA，而不降解同 源DNA。 基因工程所用的限制性内切酶可从生产 厂家购买，如NEB, Fermentas, SibEnzyme。 国内市场上常用的是TaKaRa。
基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于 基因工程各种酶的总称，包括核酸序 列分析、标记探针制备、载体构建、 目的基因制取、重组体DNA制备等所 需要的酶类。
第一节 限制性核酸内切酶
在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型 的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏 入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源 DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化 酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可 免遭自身限制性内切酶的破坏。 限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内 切酶降解外源DNA ，维护自身遗传稳定的保护机 制。
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名 嗜血流感杆菌d株 嗜血流感杆菌 株
Haemophilus influenzae d
Hind Ⅲ
Hind Ⅱ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的分类
特性 限制和修 饰活性 Ⅰ型 单一功能 Ⅱ型 单一功能 Ⅲ型 双功能 相距5-10bp 意义不大
限制性内切酶作用过程
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三、限制性内切酶的识别序列
限制性内切酶在双链DNA上识别的特殊核苷酸序列称为 识别序列。 绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4~8个 核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是 从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫 核酸内切酶的切割位点或靶序列。 理论上，某限制性内切酶的识别序列长度为n个核苷酸， n n 则该酶切割DNA的频率为1/4 ，也就是说DNA每隔4 个核 苷酸便 会出现一次该酶的识别序列。
3.识别序列的旁邻序列 识别序列的旁邻序列 限制性内切酶不会切割仅含有识别序列的寡 核苷酸时，识别序列两端必须要有若干个核苷酸 才能切割。 4.位点偏爱（site preference） 位点偏爱（ 位点偏爱 ） 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序 列表现出不同的切割效率。与识别序列两侧的核 苷酸序列有关。 5.DNA甲基化 甲基化
[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散
如：4µg DNA/1U 1µg DNA/1U HpaⅠ 50µl 37℃ 15h HpaⅠ 50µl 37℃ 1h
(二)限制性内切酶的用量 二 限制性内切酶的用量
50µL Buffer中，含1µg底物DNA，于最适反 应条件和温度下，保温1小时，能使1µg DNA完全 降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点 几种 型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164 Haemophilus influenzae Rd
CTGCAG GACGTC
不同核酸内切酶的特异识别位点
Pst I
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
• 例如 例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，识别顺序都是 Ⅱ Ⅰ 同裂酶， 5’……C↓CG G……3’ 3’……G GC↑C……5’ • 如果其中有 甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能够切割， 如果其中有5’-甲基胞嘧啶 甲基胞嘧啶， Ⅱ不能够切割， MspI能切割。 能切割。 能切割
经同尾酶消化的 同尾酶消化的DNA末端连接示意图 消化的 末端连接示意图
酶切反应的基本步骤
－
CK T M CK T M
加反应液
37℃ 1h
电泳
紫外分析
＋ Buffer (10 ) (10×) ddH2O DNA Enzyme Volume 2.0 µL 约16.5 µL 0.2~1.0 µg 1～2U 20.0 µL
1.0kb 1.0kb 0.6kb 0.5kb 0.4kb
识别与切 分别，随机切割， 同一位点 割位点 相距较远 在基因工 程中意义 无用 非常有用
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 限制修饰 蛋白结构 I型 多功能 异源三聚体 II 型 单功能 同源二聚体 III 型 双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ SAM GAGCC CAGCAG
生产厂家提供限制性内切酶时，包装中会附赠 该酶的最适10×反应缓冲液。 有些酶可在几种缓冲液中发挥最大活性，有些 酶必须要在该酶特定的缓冲液中才能发挥最大活 性。有些酶在某些缓冲液中会出现星号活性。 生产厂家的目录中会提供不同缓冲液中酶活力 的详细信息。
(四)限制性内切酶反应温度 四 限制性内切酶反应温度 大多数酶的最佳反应温度为37°C，也 有的高于或低于此温度。
EcoR I
5’…… G A A T T C ……3’ 3’ ……C T T A A G ……5’
HindⅢ切割位点 Ⅲ
DNA
HindⅢ Ⅲ
AA G C T T T T C G AA
DNA
A
B
A AGCTT TTCGA A
C
D
核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用
限制性核酸内切酶的切割类型： • （1）两条链上的断裂位置是交错和对称围 绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结 果形成具有粘末端的DNA片段； • （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称 轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平 末端的DNA片段。
一、限制性内切酶的命名和种类
命名： 命名：以微生物属名第一个字母和种名前 两个字母命名，后面加菌株代号的一个字母。 两个字母命名，后面加菌株代号的一个字母。 如果从同一菌株分离到多种酶， 如果从同一菌株分离到多种酶，则依次用罗 马数字I、 、 、 来表示 来表示。 马数字 、II、III、IV来表示。 前三个字母用斜体，其他字母用正体。 前三个字母用斜体，其他字母用正体。
• 3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 粘性末端（ 粘性末端
同裂酶和同尾酶
同裂酶isoschizomers ：来源不同的限制酶识别相同的 来源不同的限制酶识别相同的 核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割 Ⅱ Ⅰ均可切割C↓CGG。 。 当胞嘧啶甲基化后， 当胞嘧啶甲基化后， MspⅠ不能再切割。 Ⅰ不能再切割。 同尾酶isocaudamers ：来源不同，识别的核苷酸靶序列 来源不同， 来源不同 也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限 也不相同，但切割后 分子产生的粘性末端相同的限 制性核酸内切酶。 制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一 、 和 组同尾酶。 组同尾酶。 注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接， 注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接， 但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片 段将不能被该两种酶的任一种所识别。 段将不能被该两种酶的任一种所识别。
3’ XXXXCCTAG
3’ XXXXTCTAG