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第一章基因工程--基因工程工具--酶与载体【教学重点】DNA重组技术所需的三种基本工具的作用【学习过程】一、基因工程的概念：基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象DNA操作水平分子原理基因重组二、基因工程的基本工具1、基因工程的“分子手术刀”（1）名称：__________________________（2）来源：主要从原核生物中分离纯化。
（3）作用：能识别______________分子的________________________序列，并在特定的切点上切割DNA分子。
如EcoRI酶能使每一条链中__________和_____________之间的___________________断开。
例如： EcoRI限制酶 SmaI限制酶（4）结果：形成______________________________2、基因工程的“分子缝合针”（1）名称：__________________________。
（2）作用：恢复被限制酶切开的_____________之间的_____________。
（3）结果：形成_____________________。
(4)DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个核苷酸之间形成是否需模板作用对象在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键3、基因工程的“分子运输车”（1）名称：__________（2）作用：将外源基因送入__________（3）必备的条件：①能够在宿主细胞中____________________，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；②具有________限制酶切点，以便与______________连接；③具有某些_______________，供______________________，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因。
基因工程载体及其工具酶前言随着基因工程在生物医药等领域的快速发展，基因工程载体和工具酶的研究显得越发重要，下面将对基因工程载体和工具酶进行概述关键字：基因工程载体工具酶一：基因工程载体载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独立进行自我复制的遗传因子。
作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。
质粒载体质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。
它是闭合环状双链DNA 分子，大小1kb到200kb不等。
能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。
有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。
质粒的复制分松弛型和严谨型两种。
松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10拷贝。
一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1质粒或 ColE1质粒的复制起始位点。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
3．质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程的载体和工具酶第一节载体引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。
作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
一、质粒载体（一）质粒的生物学特性（1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA）DNA 分子。
广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。
在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。
大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。
（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。
（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。
（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为10-60。
不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。
（5）质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。
载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。
⑹质粒的转移转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。
非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。
（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，（二）质粒DNA的制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
基因载体和工具酶：基因载体可分为克隆载体和表达载体两种，其中克降载体必需具备如下条件：①具有复制原点，在宿主细胞内必需能够自主复制；②有一条或多条用于筛选的选择标记，易于识别和筛选；③具备合适的限制性核酸内切醐的单一识别位点，便于外源DNA片段的插入，同时不影响其复制；④有较高的拷贝数，便于目的基因的大量制备；⑤具有较大的外援DNA片段装载容量，又不影响本身的复制。
表达载体必需具备如下条件：①具备与克隆载体相同的复制起点、多克隆位点和筛选标记基因；②具备掌握目的基因表达的调控序列，包括启动子、转录终止子；③具备完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点。
工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶类、碱性磷酸酶、末端脱氧核甘酸转移防以及其他工具的。
基因工程诞生的理论基础：三大理论基础：①发觉了生物的遗传物质是DNA而不是蛋白质；②明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制基质；③遗传密码子的破译。
三大技术基础：①采用限制性内切酶和DNA连接酶外切割和连接DNA片段；②质粒改造成载体以携带DNA片段克隆；③逆转转录酶的食用打开真核生物基因工程的一条通道。
胚胎原位杂交技术、Northern杂交、blot的异同点：相同点：①都是用带有标记的核酸探针，与待测核酸（RNA）片段进行杂交；②都要对进行了杂交处理的材料进行漂洗；③都要对杂交信号进行检测。
不同点：①用于标记的核酸探针种类不同：胚胎原位杂交所用探针分为DNA探针、RNA探针、cDNA 探针和寡核甘酸探针等，DNA探针还有双链和单链之分。
依据标记方法的不同也可分为放射性探针和非放射性探针：对于Northern/blot而言，其探针为同位素或生物素标记的DNA或RNA探针对固定于膜上的mRNA进行杂交。
②胚胎原位杂交需要两条恒氨酸单链片段，在相宜条件下，能形成DNA-DNA. DNA-RNA或RNA-RNA双链分子；而Northern、blot则是针对RNA样品。
基因工程的载体和工具酶第一节 载体引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达， 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于 来实现。
作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点（MCS ）,便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
一、质粒载体（一） 质粒的生物学特性（1） 质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状 （少数为线形和 RNA ） DNA 分子。
广泛从在于细菌细胞中， 比病毒更简单。
在霉菌、 蓝藻、 酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒， 目前对细菌的质粒研究得比较深入， 特别是大肠杆菌的质粒。
大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒（F 因子）、R 质粒（抗药性因子）和 Col 质粒（大肠杆菌素因子）三种。
（2） 质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大 的达到 200kb 。
（ 3 ）质粒的生存在寄主细胞中 “友好 ”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往 往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。
（4） 质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
据拷贝数将 质粒分为两种复制型： 严紧型"质粒（stigent plasmid ），拷贝数为1-3 ；松弛型"质粒（relaxed plasmid ） ,拷贝数为 10-60。
不过即使是同一质粒， 其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生 长环境也可能有很大的变化。
（5）质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。
载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。
⑹ 质粒的转移转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。
非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。
（ 7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，（二） 质粒 DNA 的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA 。
这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA 。
1. 碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展 出来的。
在pH 值12.0〜12.5范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不 会被变性。
通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性， 通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得 质粒 DNA 。
2. 碱变性法提取质粒的步骤：而目的基因本身无法进行复“载体 ”及其“寄主细胞(1)取 1.5 毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；(2)加入100 微升冰冷的溶液I，(50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA ) 涡旋震荡悬浮菌液。
(3)加入200微升新配制的溶液II , (0.2M NaOH , 1.0%SDS)缓缓混匀置室温5分钟。
(4)加入150毫升冰冷的溶液III ,(醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升)颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。
(5)离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA 。
(三)质粒载体的改造⑴去掉不必要的DNA 区段。
⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。
(单一的限制性酶切位点)。
⑶加入易于捡出的选择性标记基因。
⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。
⑸改造或增加基因表达的调控序列。
1 、质粒pBR322结构：( 1 )氨苄青霉素抗性基因( ampr 或Apr)内部有 3 种限制酶单一识别位点。
( 2)四环素抗性基因( tetr 或Tcr)内部有7 种，启动区内有 2 种限制酶单一识别位点。
( 3) DNA 复制起点( ori) pBR322 质粒的优点：( 1 )具有较小的分子量。
4363bp , 2.6X 106Da,(2)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
(3)具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000〜3000个拷贝。
(4)对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。
2、pUC 质粒载体1987 年，J.Messing 和J.Vieria 采用MCS 技术在pBR322 基础上构建的。
结构：( 1 )来自于pBR322 的Ori(2)氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。
但核苷酸序列发生了变化(3)LacZ '基因编码B —半乳糖酶的a —肽链即氨基末端。
( 4) MCS 区段是一段用于插入外源DNA 片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。
与pBR322 相比，pUC 质粒载体优点：(1)具有更小的分子量和更高的拷贝数女口pUC8为2 750bp, pUCI8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500〜700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。
（3）具有多克隆位点区段（MCS ）可以定向克隆防止载体自我连接。
二、噬菌体载体（一）噬菌体载体1. 噬菌体的生物学特性烈性噬菌体：只具有溶菌生长周期温和噬菌体：具有溶源生长周期和溶菌生长周期溶菌周期指噬菌体将DNA 注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。
溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA 是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。
在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA 被称为原噬菌体。
2. 噬菌体的生物学特性⑴组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。
DNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。
当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA 分子。
上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos 位点（cohesive end site）.⑵是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。
⑶复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是"复制，晚期进行滚环复制⑷基因组成DNA 至少包括61 个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3 为非必须区段。
3. 噬菌体载体的类型插入型（Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA 插入的克隆位点。
如：入gt10、入gt11克隆能力小，不到10kb置换型（Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的入DNA区段是入噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA 取代。
如Charon 4 载体克隆能力大，20〜25kb（二）M13 噬菌体1、丝状噬菌体M13 噬菌体的生物学特性⑴是单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb,可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。
这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。
⑵复制与增殖（图）2. M13噬菌体载体的构建⑴ 在IS区内插入LacZ基因⑵在标记基因区内组装MCS区段所以能通过互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。
这类载体包括了M13mp8、9和M13mp18、19 等这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。
其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。
所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。
（三）柯斯质粒载体1•柯斯质粒载体的特点柯斯质粒是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid 是cos site carrying plasmid 的缩写。
柯斯质粒的大小为4-6kb,由3部分组成：A. 多克隆位点区B. 含有cos位点的DNA区C. 复制起始位点和抗性标记区2•柯斯质粒载体的特性1、具有噬菌体的特性柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。
进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。
2、具有质粒载体的特性能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。
3、高容量的克隆能力cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。
不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。
第二节基因操作的工具酶一、限制性核酸内切酶及其应用（一）限制性核酸内切酶的发现当入（k）噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。
而 E.coliB 的DNA 中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB 甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM ）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。
EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan,大肠杆菌B和K菌株，EcoB 和EcoK，是I 型的，没有实用价值。
首个II 型限制内切酶是在1970年,由H.O.Smith 等从Heamophilus influenzae 的Rd 菌株中Hind II 。
使得DNA 分子的体外精确切割成为可能。
从此, 相关研究展开。
如NEB 公司的提取和克隆。
目前已纯化出3000 种限制性内切酶中,其中有30%是在NEB 发现的。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
切开的是3, 5－磷酸二酯键。
（二）限制性核酸内切酶的分类分为I 型、II 型和III 型。
（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3 个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称,如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin ；2、用一个正体字母表示菌株的类型,比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系, 则用罗马数字标出, 比如Eco R I、Hind III。
