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高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography（HSCCC）逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层析的方法，将不同溶质分离。
逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱，经历了近60年的历程，技术和设备均已日益成熟，现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。
高速逆流色谱特点：! 无不可逆吸附# 液—液层析系统，无样品与固定相之间的不可逆吸附! 高回收率# 流动相和固定相均为液体，样品可全部回收! 操作简便# 固定相为液体，体系更换、平衡方便、快捷。
高速逆流色谱原理：高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。
在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。
图1是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。
上图，在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个截然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域（混合区）呈现两相的激烈混合。
其余区域（静置区）两溶剂相分成两层：较重的溶剂相在外部，而较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。
下图，I到IV的展开柱，分别与上图中I到IV位置相对应，每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动（与海面波的运动相似）。
在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800rpm旋转时，频率超过13次/秒，流动相则不断地穿过固定相。
所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内，仍有相当高的分配效率。
图1 螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配高速逆流色谱应用：1. 旋转速度在逆流色谱中，留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，一般说来，高保留量会大大改进峰分离度。
高速逆流色谱仪原理特点及应用一、简介高速逆流色谱（HPLC）是一种高效、精准的分析技术，它广泛应用于化学、制药、环保、食品等领域。
高速逆流色谱仪是高速逆流色谱技术的核心设备，能够对各种化合物进行分离和检测。
在本文中，我们将介绍高速逆流色谱仪的原理、特点及应用。
二、原理高速逆流色谱仪使用液相色谱技术，其基本原理是将待测样品溶液经过一定的处理后，注入色谱柱，通过色谱柱内液相的物理化学作用，将各种组分分离出来，并用检测器检测分离出来的化合物。
高速逆流色谱仪相较于其他色谱仪的优势在于可以在极短的时间内完成大量的分离、检测等操作。
高速逆流色谱仪的原理是基于其内部的色谱柱，其内部结构可以细分为装载柱、色谱柱和联接管。
样品通过色谱柱时，每种组分将被一步一步地分离出来，直到达到检测器，最后数据将被转换为电子信号，并通过数据处理软件进行分析和处理。
三、特点1. 高效HPLC技术的一大优势在于其高效性，使用HPLC技术可以在更短的时间内分离出更多的物质成分，从而提高分析效率。
2. 精准由于高速逆流色谱仪的高分辨率和灵敏度，其能够分离出复杂物质的成分，从而提供更加准确的结论。
3. 多种检测方式高速逆流色谱仪可使用不同类型的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，可以检测多种类型的化合物成分。
4. 适用范围广高速逆流色谱仪不仅适用于小分子化合物的分离和检测，也可以用于生物大分子、天然产物、有机和无机化合物等物质的分离和检测。
四、应用高速逆流色谱仪广泛应用于化学、生命科学、环境科学、食品科学等领域，其准确性和高效性为这些领域的研究和实践提供了重要的技术支持。
1. 化学在化学领域中，高速逆流色谱仪通常在合成新药物、分离小分子化合物、分析毒物、研究反应机理等方面有着广泛的应用。
2. 生命科学高速逆流色谱仪在生命科学领域可以用于分析蛋白质、氨基酸、核酸和多糖等生物大分子，可以检测蛋白质含量和组成，研究生物大分子的三维结构，为分子生物学、细胞生物学和基因工程研究提供技术支持。
高速逆流色谱仪原理特点及应用气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇进行疏通处置，这可除去管路内大部分颗粒状堵塞物及易被乙醇溶解的有机物和水分。
在此疏通步骤中，如发觉管路不通，可用洗耳球加压吹洗，加压后仍无效可考虑用细钢丝捅针疏通管路。
如此法还不能使管线畅通，可使用酒精灯加热管路使堵塞物在高温下炭化而实现疏通的目的。
用无水乙醇清洗完气路管路后，应考虑管路内壁是否有不易被乙醇溶解的污染物。
如没有，可加热该管线并用干燥气体对其吹扫，将管线装回原气路待用。
假如由分析样品过程判定气路内壁可能还有其它不易被乙醇溶解的污染物，可针对实在物质溶解特性选择其它清洗液。
选择清洗液的顺序应先使用高沸点溶剂、而后再使用低沸点溶剂浸泡和清洗。
可供选择的清洗液有萘烷、N、N—二甲基酰胺、甲醇、蒸馏水、丙酮、乙醚、氟里昂、石油醚、乙醇等。
对进样器（包含汽化室）的清洗应以疏通为先导。
通常在进样器中的堵塞物是进样隔垫的碎片，样品中被炭化了的高沸点物，对这些固态杂质可用不锈钢捅针疏通，然后再用乙醇或丙酮冲洗。
为了使清洗更彻底，可选用2：1：4的H2SO4/HNO3/H2O混合溶液先对进样器清洗，然后再用蒸馏水，最后再用丙酮或乙醇清洗。
清洗完后烘干，装上仪器通载气半小时，加热到120℃待几小时后即可正常工作。
在拆装进样器时需注意不要碰断加热器引线或使引线碰到外壳；测温元件也应在装回进样器之后，按原先测温点装回。
通常测温元件和进样器加热体是紧密接触的，如距离过大将会造成过高的汽化温度。
注射器使用前可先用丙酮清洗，以免玷污样品，但可以还是用待注射样品对注射器自身做一二次清洗。
高速逆流色谱法的概况及应用高速逆流色谱( High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC) 是Yoichiro Ito 博士于二十世纪八十年代首先研发、应用并发展起来的一种新型液-液分配色谱技术；HSCCC运用同步多层螺旋管进行行星式离心运动，使得在互不相溶的两相溶剂系统中可以实现样品在短时间内的高效分离，从而制备样品[1,2]。
高速逆流色谱技术不需要固体支撑物，主要根据样品在两相中所具有的不同分配系数进而对样品进行分离，相对于其他色谱技术如高效液相色谱、柱色谱等来说，具有高回收率、无吸附损耗、无峰拖尾等优点。
1、HSCCC法概况1.1 HSCCC法的基本原理HSCCC属于液 -液分配色谱，所以其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，即利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。
而 HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内 ,建立起一种单向性流体动力平衡体系。
螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，成行星运动[3]。
这样 ,加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。
HSCCC技术已经广泛应用于天然产物的分离。
1.2 溶剂系统的选择利用 HSCCC分离物质的关键是溶剂系统的选择。
经查阅多篇文献，总结要点如下。
对用于 HSCCC分离的溶剂体系，应该满足这几方面的要求：1)不造成样品的分解与变性；2)足够高的样品溶解度；3)样品在系统中有合适的分配系数值；4)固定相能实现足够高的保留[4]。
而对于溶剂体系选择的原则，Ito博士本人总结的几个要点是这样描的：1)待分析组分应易溶于溶剂系统 ,并不与之发生反应；2)溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相，以免浪费溶剂；3)组分在溶剂系统中的分配系数 K应为适当的定值 (0.5≤K≤1)；4)固定相的保留值要满足一定要求 (保留值越大峰形越好 )。
溶剂系统的一般选择方法：HSCCC是利用溶质在不同溶剂中的分配进行分离的，所以在溶剂选择时要重点考虑溶质在两溶剂中的分配系数。
因而准确测定待分离组分在两相中的分配系数，即可选择出合适的溶剂系统[5]。
常见的溶剂体系有以下几种：1)弱极性溶剂体系；2)中等极性溶剂体系；3)强极性溶剂体系。
这三种溶剂体系分别可以用于分离相应性质的天然产物。
而测定组分的分配系数，常采用高效液相色谱法、薄层色谱法等方法，都能够较为准确地测定特定组分的分配系数值。
HPLC法即将适量的样品分别溶于已平衡的两相溶剂，待分配平衡后，进行 HPLC测定，通过得到的色谱峰面积可精确计算出样品在两相间的分配系数[6]。
程杰[7]等从红车轴草提取物中分离芒柄花素和鹰嘴豆芽素A时,采用 HPLC测定 K值的方法最终确定了溶剂体系为正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (2∶1.5∶1.5∶2)。
薄层色谱法则是利用样品在等体积上下相中分配平衡后用薄层色谱展开,通过薄层色谱得到的斑点判断组分的分配情况[8]。
1.3 HSCCC法的优点及发展情况HSCCC所有的优点都源于其不用固体固定相，有广泛的溶剂体系可供选择，它独特的优点概括起来为：1)HSCCC不用固体支撑体，避免了由于样品与固定相发生作用而导致的不可逆吸附、污染、变性等缺点；2)分离过程不是吸附与淋洗的过程，而是对流穿透的过程，所以能节省昂贵的填料费用，节约溶剂的消耗；3)由于可选的溶剂系统非常多，故其可以分离各种不同极性范围的物质，适用范围广。
而其缺点在于溶剂系统选择没有一个完整的、有指导意义的理论体系。
近年来，由于此项技术具有很多独特的优点，国内外对 HSCCC的研究越来越多，应用也越来越广。
就天然产物分离而言，曹学丽[9]在其著作中列举了如下几个方面:天然药用植物活性成分分离及标准品制备、快速分离和重要指纹图谱分析、天然新药的研发和筛选。
可见，HSCCC技术在天然产物分离中有着广泛的应用。
2、HSCCC法的应用。
2.1 在天然药物活性成分研究中的应用2.1.1 生物碱类生物碱广泛分布于植物界，对疾病治疗和药物开发等具有重要意义。
近年来，用 HSCCC 已成功分离了多种生物碱。
Li 等[10]用 HSCCC 分离辣椒粗提物中的辣椒碱，以四氯甲烷-甲醇-水（4 ：3 ：2）为溶剂系统，下相为流动相。
得到二氢辣椒碱、辣椒碱的纯度分别为 97.4%和99.0%。
吴三桥等[11]用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（22 ：25 ：23 ：17）为溶剂体系，从延胡索总碱中一步纯化得到原阿片碱和延胡索乙素，纯度分别为99.3% 和 98.8%，可作为延胡索乙素、原阿片碱化学对照品的制备分离方法。
梁镇然等[12]用 HSCCC 与硅胶柱层析联用分离岩黄连中的 2 种原小檗碱型季胺生物碱，选定正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水-氨水（0.4：1.5：4 ：0.4 ：5 ：0.11）为两相溶剂系统，下相为固定相，上相为流动相，通过 1 次高速逆流色谱，即可得到纯度为97.0% 的去氢碎叶紫堇碱。
HSCCC 还成功分离了长春花中的长春新碱[13]、红豆杉中的三尖杉宁碱[14]、附子中的苯甲酰新乌头碱[15]、白鲜皮中的白鲜皮碱[16]、钩吻中的钩吻碱[17]、蓖麻籽中的蓖麻碱[18]等。
2.1.2 黄酮及其苷类黄酮类化合物多存在于高等植物和蕨类植物中，常以游离或苷的形式存在，生理活性多种多样。
传统的制备方法是柱层析或薄层层析，操作繁琐，收率较低。
改用HSCCC法后，目标组分的分离效率增加，纯度也得到相应提高。
袁媛等[19]利用HSCCC分离纯化木蝴蝶中的黄酮类活性成分，以氯仿-甲醇- 水（9.5：10：5）为溶剂系统，从木蝴蝶乙酸乙酯粗提物中得到 5 种化合物，分别为白杨素、黄芩素、黄芩素-7-O-葡萄糖苷、黄芩素-7-O-双葡萄糖苷和一种新的白杨素双葡萄糖苷，各成分的纯度均＞97%。
孙印石等[20]用HSCCC分离制备陈皮中的黄酮类化合物，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（2 ：4 ：3 ：3）为两相溶剂系统，从陈皮粗提物中一步分离制备得到橙皮苷、桔皮素和5-羟基-6，7，8，3，4-五甲氧基黄酮，纯度均＞97.0%。
2.1.3 木脂素和香豆素类香豆素类成分广泛分布于高等植物的根、茎、叶、花、果实、种子等各部位。
木脂素是 2 个苯丙烷骨架结构通过其中的β，β或 8，8'-碳相连的一类天然产物，其结构多样。
这两类化合物的分离纯化难度较大，但HSCCC法的使用解决了这一难点。
Cazal等[20]以环己烷-乙醇-乙腈-水（10 ：8 ：1 ：1）为溶剂系统，上相为流动相，下相为固定相，利用HSCCC从橙树根中分离出花椒内酯，纯度＞99%。
Shi等[21]采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水（2 ：5 ：7），下相为流动相，用HSCCC从蒲公英中分离纯化木脂素，从蒲公英提取物中一步获得蒙古蒲公英素A 和 rufescidride，纯度分别为98.7% 和98.5%。
此外，HSCCC还可以用于分离纯化续随子中的七叶内酯[22]、连翘中连翘苷[23]、五味子中的五味子酚[24]、望春花中的木兰脂素[25]等。
2.2建立指纹图谱[26] :鉴于HSCCC 有很好的分辨率和重现性，一般分离物有2 ～ 3以上的组分峰,不仅可定性定量分析，还可以制定出某一天然产物的特征峰和指纹图谱，进而制定标准图谱用于天然药物的质量控制，并且通过调节溶剂系统可以对非极性、极性等任何极性范围的物质进行分离鉴定，应用较为广泛；另一方面，HSCCC具有分离时间短、快速、方法简单的特点，且仪器本身廉价易于推广，具有良好前景。
顾铭等[27]选用正己烷、乙醇、水体系，采用分步洗脱，分离纯化 3 个不同产地丹参提取物，各分离得到 12 个洗脱组分，经高效液相色谱仪和紫外光谱仪检测证明3张HSCCC洗脱图谱中对应洗脱峰为同一组分。
HSCCC 洗脱图谱不包含非共有峰，并且对应洗脱峰保留时间的相对标准偏差<3 %，符合国家标准关于制订指纹图谱方法学考察资料的技术参数。
因此，HSCCC 作为制订指纹图谱的方法之一具有可行性。
3、展望HSCCC 其分离度和重现性与 HPLC 相似，但仪器价格低廉、性能可靠、分析成本低、易于操作，是一种适用于中药和天然产物研究的现代化仪器。
对于天然药物的提取分离非常适用。
在质控方面，可用于中药和天然产物的定性定量分析，若能进一步研究，整理出中药材一系列的特征和色谱指纹图谱，用于中药材、中药饮片的质量控制，将能提供一种快速、简便、价廉的新方法和新标准。
现在 HSCCC 在国外已经广泛应用，但在国内还非常有限，深度和广度均不够，仅在天然药物的提取分离中略有应用，在中药的质量分析和控制中应用还很少，鉴于HSCCC本身所具有的优点，相信在以后应用会越来越广泛。
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