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l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱技术目录介绍 (1)高速逆流色谱的原理 (1)1.系统描述 (2)1.1主机 (2)1.2恒流泵 (2)1.3紫外检测器 (3)1.4恒温循环器 (3)1.5色谱工作站 (3)2.主机描述 (3)2.1操作 (4)2.1.1传感器控制面板 (4)2.1.2电源开关 (4)2.1.3样品进样口及样品出样口 (4)2.1.4进口 (4)2.1.5出口 (4)2.2六通阀 (4)2.3进样步骤 (8)2.4控制面板 (9)2.4.1功能键介绍 (9)2.4.2控制面板的操作 (9)2.5TBE-300B高速逆流色谱的工作流程 (10)3.安装 (10)3.1检查包裹 (10)3.2安装环境 (10)3.3连接管 (10)3.4连接保温系统的管路 (11)3.5连接信号线 (12)4.操作 (12)4.1准备 (12)4.2操作程序 (12)4.3系统平衡 (13)4.3.1单泵平衡 (13)4.3.2双泵平衡 (14)4.4样品分离 (14)5.维护 (14)5.1清洗系统 (14)5.2警告 (15)6.系统特性及工作参数 (15)附录A (15)附录B (16)附录C (17)同田生物介绍逆流色谱（CCC）是一种无固体载体支持的液-液分配色谱技术。
与其他柱色谱相比，逆流色谱不会导致不可逆吸附，样品，变性，污染及等问题。
除此之外，它能够分离分子量从小变到大的化合物，甚至一些生物大分子。
高速逆流色谱（HSCCC）是逆流色谱中的最新的发展。
高速逆流色谱不仅减少的分离时间，而且也极大地提高了分离度和制备能力。
高速逆流色谱的应用：1、制备性地分离毫克到克规模的样品；2、从粗样品中分离目标化合物；3、分离放射性同位素。
高速逆流色谱在分离天然产物中的优势：1、更加方便和迅速；2、不需要对样品进行前处理；3、液-液分配容积系统的选择广泛；4、因为没有固体载体，所以无死吸附，无污染；5、高的重现性及重复性。
高速逆流色谱法的概况及应用高速逆流色谱( High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC) 是Yoichiro Ito 博士于二十世纪八十年代首先研发、应用并发展起来的一种新型液-液分配色谱技术；HSCCC运用同步多层螺旋管进行行星式离心运动，使得在互不相溶的两相溶剂系统中可以实现样品在短时间内的高效分离，从而制备样品[1,2]。
高速逆流色谱技术不需要固体支撑物，主要根据样品在两相中所具有的不同分配系数进而对样品进行分离，相对于其他色谱技术如高效液相色谱、柱色谱等来说，具有高回收率、无吸附损耗、无峰拖尾等优点。
1、HSCCC法概况1.1 HSCCC法的基本原理HSCCC属于液 -液分配色谱，所以其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，即利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。
而 HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内 ,建立起一种单向性流体动力平衡体系。
螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，成行星运动[3]。
这样 ,加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。
HSCCC技术已经广泛应用于天然产物的分离。
1.2 溶剂系统的选择利用 HSCCC分离物质的关键是溶剂系统的选择。
经查阅多篇文献，总结要点如下。
对用于 HSCCC分离的溶剂体系，应该满足这几方面的要求：1)不造成样品的分解与变性；2)足够高的样品溶解度；3)样品在系统中有合适的分配系数值；4)固定相能实现足够高的保留[4]。
而对于溶剂体系选择的原则，Ito博士本人总结的几个要点是这样描的：1)待分析组分应易溶于溶剂系统 ,并不与之发生反应；2)溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相，以免浪费溶剂；3)组分在溶剂系统中的分配系数 K应为适当的定值 (0.5≤K≤1)；4)固定相的保留值要满足一定要求 (保留值越大峰形越好 )。
高速逆流色谱及其应用王莉(贵州大学化学与化工学院，贵阳，550003)摘要：高速逆流色谱是近年发展起来的，不使用固定相载体的新型液液逆流色谱。
本文介绍了高速逆流色谱的工作原理，HSCCC在的分离方面具有很大的优势，具有非常广阔的应用前景。
本文主要综述了HSCCC在天然产物、生物医药和其他方面的应用情况。
关键词：高速逆流色谱；天然产物；分离；应用Application of High Speed Countercurrent ChromatographyWANG Li（School of Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550003，China）Abstract:The high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) is developing in recent year which without fixed carrier. The work principle，characteristics of HSCCC were introduced in this paper，which summarized the application and purification of HSCCC on the natural product，biomedicine and so on，especially the application on the fields of purification and isolation natural product．Key words: HSCCC; natural product; isolation; application引言高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。
它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。
目前HSCCC技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。
1 高速逆流色谱原理高速逆流色谱是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。
流动相不断穿过固定相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小次序被依次洗脱。
高速逆流色谱仪器的装置如图1所示，它的公转轴水平设置，螺旋管柱距公转轴R处安装，两轴线平行。
通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。
图 1 高速逆流色谱仪器装置示意图Fig.1 Illustrative diagram of instrument installation of HSCCC在对管柱里两相溶剂状态进行频闪观察时发现，在用选定溶剂体系的下相作流动相的条件下，管柱里会出现如图2所示的分布区带。
在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个绝然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，呈现两相的激烈混合(混合区)；其余区域两溶剂相分成两层(静置区)，较重的溶剂相在外部，较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。
然后根据各自的分配系数不同而先后被洗脱出来，达到分离的目的。
图2 高速逆流色谱螺旋管内溶剂体系的区域分布图Fig.2 Diagram of distribution of solvent system in the rotating coil in HSCCC2 HSCCC的应用2.1 HSCCC在生物医药中的应用随着当前生物医药等研究领域的迅猛发展，越来越多的天然产物(包括对一些具有高附加值的天然活性分子)的提取分离，特别是药物中间体的合成过程中有效成分的分离，都需要建立快速、高效的现代分离方法，而高速逆流色谱法对于加强上述领域的药物开发支持体系提供了一条崭新的途径。
2.1.1 氟吗啉原药中有机杂质的分离氟吗啉(flumorph)是沈阳化工研究院创制开发的含氟二苯丙烯酰吗啉类杀菌剂，化学名称为4-[3-(3, 4-二甲氧基苯基)-3-(4-氟苯基)丙烯酰]吗啉。
氟吗啉有2种互变异构体z型和E型。
王远[1]等应用高速逆流色谱，选择正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(体积比1：l：1：1 )为两相体系对氟吗啉原药进行分离纯化，并用高效液相色谱法测定分离物的纯度。
结果表明：经过高速逆流色谱1次分离，除活性组分氟吗啉外共分离得到3个纯度超过95％的有机杂质。
2.1.2 分离纯化续随子种子中七叶内酯药理实验表明：七叶内酯具有抗炎、抗菌止咳、祛痰、平喘等药理作用[2]。
现代研究证明：续随子种子中含有香豆素类成分，其中七叶内酯具有促进血液循环的作用，动物实验结果表明其具有增加尿量和促进尿酸从组织中排出的效果，这与中医的逐水消肿作用一致[3]余霞等[4]建立了HSCCC技术分离纯化续随子种子中七叶内酯的方法。
将续随子种子的乙酸乙酯萃取物直接进行高速逆流色谱分离，考察了不同溶剂系统的分离效果。
结果表明，最佳的溶剂系统为氯仿-甲醇-水(体积比为4：3：2)，以其上相为固定相，下相为流动相。
从200 mg续随子种子乙酸乙酯萃取物中分离得到80 mg七叶内酯，纯度为99.04％。
HSCCC技术可高效分离纯化续随子种子中的七叶内酯，为得到高纯度的七叶内酯提供了制备技术。
2.1.3 分离制备麦角甾醇纯品蝙蝠蛾拟青霉最早是从冬虫夏草样品(昆虫为虫草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus Oberthiir的幼虫(僵虫))上分离得到的，其菌丝粉在化学成分、药理作用及临床效果上与天然虫草基本一致，具有补肺益肾、秘精益气之功效。
现代研究表明，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的主要化学成分有麦角甾醇(ergosterol)、麦角甾醇过氧化物、正二十五烷酸、大豆素、对羟基苯乙酸甲酯、类生物碱物质等，其中麦角甾醇是主要有效成分。
麦角甾醇是脂溶性维生素D2的前体，当受到紫外线照射时可转化为维生素D2，它是一种重要的医药化工原料，可用于可的松、黄体酮等药物的生产，在食品、医药和饲料工业中应用广泛。
章能胜等[5]建立了用高速逆流色谱从蝙蝠蛾拟青霉中高效、快速分离制备高纯度麦角甾醇的方法。
将蝙蝠蛾拟青霉的乙酸乙酯提取物直接进行高速逆流色谱分离，考察了不同溶剂系统的分离效果。
结果表明，最佳的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为6：1.7：6：0.3)，以上相为固定相，下相为流动相，转速为850r／min，流速为2 mL／min，检测波长为280nm。
制备所得的麦角甾醇经紫外光谱(UV)和高分辨质谱(HRMS)鉴定及与标准品对照定性；纯度经高效液相色谱( HPLC)分析为99.2％(峰面积归一化法)。
该方法制备麦角甾醇简便、快速，所得产物的纯度高，适合于麦角甾醇对照品的制备。
2.2 HSCCC在天然产物分离中的应用2.2.1 生物碱类生物碱是重要的天然含氮化合物，对疾病治疗和药物开发等具有重要意义。
近年来，用HSCCC已成功分离了多种生物碱。
分离生物碱成分常用的溶剂体系是正已烷-乙酸乙酯-甲醇(或者乙醇、正丁醇)-水体系及三氯甲烷-甲醇-水体系[6]。
程悦[7]等应用高速逆流色谱法分离制备了苦茶中的苦茶碱。
以正己烷-二氯甲烷-甲醇-水(体积比为1：5：4：2 )为两相溶剂系统，在主机转速800 r／min、流速2.0 mL／min、检测波长278 nm条件下进行分离制备。
所得流分经高效液相色谱法检测，与对照品进行比较，并通过质谱、核磁共振氢谱、碳谱鉴定化合物的结构。
结果表明，从2.22 g苦茶总生物碱提取物中分离得到了3个化合物，分别为可可碱5 mg，苦茶碱389 mg，咖啡碱41 mg，纯度均在99％以上，系首次采用高速逆流色谱法对苦茶中的苦茶碱进行分离。
该法具有简便、快速的优点。
Tang[8]等以乙酸乙酯-n-正丁醇-甲醇-2％盐酸(3.5：1.5：2：4.5)为两相系统从黄花乌头中分离开出GFT，GFU两种生物碱，并且两种生物碱的纯度都大于95％。
2.2.2 黄酮类黄酮类化合物多存在于高等植物和蕨类植物中，常以游离或与糖结合成苷的形式存在，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中多为游离苷元。
主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。
分离极性较大的黄酮苷类成分时，一般应用正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂系统，并适当增加体系的极性。
分离游离的黄酮类化合物常用氯仿-甲醇-水体系。
利用HSCCC技术能够有效地分离黄酮类化合物。
已见报道用氯仿-甲醇-水(4：3：2 )体系分别分离了陈皮和沙棘中的橙皮苷和茨非醇[9]；用氯仿-甲醇-水(4：3：2)体系曾从芫花总黄酮中分离得到羟基芫花素、洋芹素、木樨草素”[10]；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：3：l：6)体系从红茶分离了茶黄素[11]；用氯仿-甲醇-水(10：7：3)分离了雪莲中的黄酮类成分[12]；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9：l：5：5)从掌叶大黄的根茎中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素”[13]。
用乙酸乙酯-正丁醇-水( 2：l：3) 溶剂系统，可以从葛根粗提物中进一步分离包括葛根素在内的七个异黄酮化合物[14]。
2.2.3 木脂素和香豆素类报道用正己烷-甲醇-水( 6：5：5 ) 溶剂系统从江花五味子果实的核的乙醇萃取物中分离了2个结构十分相似的木脂素的成分-schisanhend及其乙酸化物[15]；氯仿-甲醇-水( 13：7：8 ) 的两相体系分离并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素和7-羟基香豆素[16]。
