酶法拆分手性化合物 -

氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸浙江大学硕士学位论文氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸姓名：钟琦申请学位级别：硕士专业：生物化学工程指导教师：关怡新20040201摘要氨基酸是构成蛋白质的基础，同时也是一种十分重要的营养物质，它在生命活动中起着举足轻重的作用。

在传统的２０种天然氨基酸中，除没有手性中心的甘氨酸外，其他１９种氨基酸均为Ｌ构型。

随着研究的不断深入，越来越多非天然构型一Ｄ型氨基酸的作用被发现，它们的需求也随之产生。

对于Ｌ型和Ｄ型都有利用价值的氨基酸，化学合成结合手性拆分的方法，具有低成本、适于大规模生产等优点。

而高效、绿色、安全的氨基酰化酶法拆分，是拆分氨基酸的最佳方法之一。

蛋氨酸和苯丙氨酸，都是人体必需的氨基酸。

喹｝氨酸是一种重要的饲料添加剂。

Ｌ．苯丙氨酸是合成抗病毒和抗癌药物及人工甜昧剂的原料，Ｄ．苯丙氨酸能增强人体的免疫功能，具有出色的镇痛作用。

首先，选取了氨基酰化酶含量较为丰富且方便易得的米曲霉３０４２作为酶源。

通过硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０凝胶层析和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子交换层析从米曲霉３０４２中提取到了米曲氨基酰化酶，该酶的纯化倍数为５４．２９，比活为６４７．６６Ｕ／ｍｇ，总收率为４９．５３％。

以Ｎ．乙酰．ＤＬ－蛋氨酸为底物的酶促反应最适ｐＨ为７．５．８．０，最适反应温度随催化反应时间的延长而降低，缓冲体系中的离子对酶活有抑制作用，而低浓度的ｃ０２＋对酶活有激活作用。

将游离酶用于拆分Ｍｅｔ和Ｐｈｅ。

最佳拆分条件和拆分结果分别为：Ｍｅｔ：反应温度为３７℃；ｐＨ７．５；Ｃ０２＋浓度为５×１０４ｍｏｌ／Ｌ；初始底物浓度为０．３ｍｏｌ／Ｌ。

产品：Ｌ－Ｍｃｔ，％Ｏ．Ｐ＝９６．２％，收率７０．５％；Ｄ．Ｍｅｔ，％Ｏ．Ｐ＝－９５．３％，收率５０．５％。

Ｐｈｅ：反应温度为３７℃；ｐＨ７．０；ｃ０２＋浓度为５×１０＂４ｍｏｌ／Ｌ；初始底物浓度为０．２ｍｏｌ／Ｌ。

手性分离方法及其在制药业中的应用手性分离是指将一个化合物中的手性异构体分离开的过程。

手性异构体是指分子的空间构型不同，但与化学性质相同的物质。

它们常常在药物合成、生物活性和代谢等方面表现出截然不同的性质。

因此，在制药业中，对手性异构体进行分离和纯化对于提高药物的效力和降低副作用具有重要的意义。

本文将介绍手性分离方法及其在制药业中的应用。

手性分离的方法手性分离的方法包括物理分离法和化学分离法两种。

物理分离法主要有晶体分离法、手性柱层析法、手性薄层层析法、手性毛细管电泳法等。

化学分离法主要有手性试剂法、拆分法和酶法等。

晶体分离法是指利用晶体的对映异构体间形成的晶体格构成分离，这种方法只适用于具有成分相对简单、结构相对规则、易于结晶的化合物。

手性柱层析法是指利用手性相对异构化合物与手性固定相之间的相互作用分离手性异构体。

手性薄层层析法是指将手性固定相包覆于薄层层析板上进行手性分离。

手性毛细管电泳法是一种基于手性分子在毛细管中运动速度的不同进行分离的方法。

手性试剂法是指使用手性试剂合成手性化合物。

拆分法是指利用天然物质中富集的手性化合物进行分离。

酶法是指利用手性酶对手性化合物进行分离。

这些手性分离方法各有优劣，不同的化合物和需要不同的效果时需要选择不同的方法进行分离。

手性分离在制药业中的应用手性异构体在制药业中有着重要的应用价值。

由于手性异构体的生物活性和代谢性质存在巨大差异，对其进行手性分离可以提高药物效力，降低毒副作用。

因此，手性分离技术得到了广泛应用。

手性分离技术在制药业中主要应用于以下方面：1、对于已经发现的手性药物，需要进行其手性异构体的分离和纯化，以提高药物的效力和降低副作用。

2、对于尚未发现的手性药物，在药物的设计和合成过程中，应该保持手性信息的完整性，并进行手性维度上的控制，以使药物具有更好的效果。

3、手性分离技术可以用于鉴别药品的真伪和质量。

在中国，由于其传统文化中强调的“天人合一”等理念，有许多假药威胁到民众健康。

手性化合物的拆分方法
手性化合物的拆分方法主要有对映体分离法和酶催化法两种。

对映体分离法是指通过物理或化学方法将手性化合物中的对映体分离开来。

常用的物理方法有晶体分离法和对映体选择性结晶法。

晶体分离法是指利用手性化合物结晶时的差异，通过适当的选择溶剂和结晶条件，使其中一个对映体结晶出来，而另一个对映体仍保持在溶液中。

对映体选择性结晶法则是利用对映体结晶时晶体生长速度的差异，通过选择合适的溶液浓度和温度，使其中一个对映体的晶体生长速度比另一个对映体快，从而实现对映体的分离。

酶催化法是利用手性化合物和酶之间的反应性差异进行对映体分离的方法。

酶催化法主要通过酶的手性选择性来实现对映体的分离，其中最常用的是立体选择性催化酶。

这种酶具有对手性底物具有高选择性催化作用的特点，通过调节反应条件和酶底物比例，可以将手性化合物中的对映体分离开来。

除了以上的方法，还有一些其他的手性化合物拆分方法，如手性色谱法、手性电泳法、手性转换法等。

这些方法则是通过物理、化学或生物学手段对手性化合物进行选择性的分离和转化，以实现对映体的分离。

手性药物拆分技术及分析手性药物（chiral drugs）是指分子内部有一个或多个不对称碳原子的药物，即具有手性结构的药物。

手性药物由于具有左右旋异构体，使得其药理学效应、药效学性质、药代动力学以及安全性能等方面出现差异。

因此，手性药物的拆分技术及分析对于药物的研发、生产和应用具有重要意义。

手性药物的拆分技术主要有下述几种方法：晶体化学方法、酶法、化学拆分、色谱法和光学活性检测。

首先是晶体化学方法，该方法是利用手性药物晶体的对称性差异完成拆分。

通过晶体中的尖、刃、拱等特征差异，将手性药物分离为晶体异构体。

其次是酶法，手性药物的拆分可以通过酶的催化作用实现。

酶是具有高选择性、高催化效率和高效底物转化率的催化剂。

通过选择合适的酶，可以将手性药物转化为对应的手性异构体或原生态精细化靶化合物。

化学拆分是指通过特定的化学反应将手性药物分解为不对称碳原子具有相反手性的产物。

该方法较为常用，但对于存储稳定性较差的手性药物较不适宜。

色谱法是利用不同手性列进行手性分离，如手性HPLC（高效液相色谱）和手性毛细管电泳等。

这些方法主要是利用手性固定相对手性药物进行分离，可达到手性药物的拆分效果。

光学活性检测是通过光学活性的手性试剂或手性染料，以手性化合物的吸光性能差异检测手性药物的拆分效果。

根据手性分析原理，通过手性分析仪器对手性药物进行检测和分析。

手性药物的分析对于药物研发、生产和应用非常重要。

分析手性药物的关键是确保其纯度和药效学性质，并且有助于合理掌握手性药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的信息。

以下是手性药物分析的一些常用方法。

首先是纳米液相色谱法，该方法是将分离的手性药物样品通过微量泵输送到纳米柱中，在极小的流速和流体容量下进行分离。

该方法对于手性药物样品的需求量很小，因此可以减少手性药物样品的消耗。

其次是循环偏振负压电流法，该方法通过测量手性药物样品对光的旋光性质，直接反应其手性结构。

该方法准确、快速，适用于灵敏度高的手性药物分析。

手性化合物拆分方法
手性化合物的拆分方法通常有以下几种：
1. 光学拆分：利用手性催化剂或其他手性物质对手性化合物进行拆分。

光学活性的手性化合物经过光学反应与手性催化剂反应可以得到单一手性的产物。

2. 液体相转移拆分：将手性化合物溶解在不对其进行反应的溶剂中，然后加入具有手性结构的离子对或分子对，形成包合物。

通过改变反应条件或进行萃取操作，可以将手性化合物从包合物中分离出来。

3. 对映体选择性结晶：通过控制结晶条件和添加适当的对映配体或样品处理剂，使手性化合物在结晶过程中选择性地形成单一手性晶体。

4. 气相拆分：利用对映体的蒸汽压差异，通过适当的气-液平衡条件和温度条件，将手性化合物分离出来。

5. 手性液相色谱：利用手性稳定相或手性固定相，在手性固定相或手性稳定相的控制下对手性化合物进行分离和拆分。

6. 酶催化拆分：利用手性酶的选择性催化作用，将手性化合物转化为单一手性的产物。

以上方法中的选择取决于手性化合物的特性、拆分要求和可用的拆分试剂或设备。

1手性化合物1.1手性自然界中有许多手性物，例如：足球，剪刀等。

微观世界的分子中同样存在着手性现象。

手性分子：不能与其镜像重合的分子。

对映体：彼此成镜像关系，又不能重合的一对立体异构体互为对映体。

手性碳原子：连有四个不同原子或基团的碳原子。

手性化合物都具有旋光性。

偏振面被旋转的方向有左旋(逆时针)和右旋(顺时针)的区别。

用符号(+)表示右旋，(-) 表示左旋。

外消旋体的定义:一对对映体等量的混合物称为外消旋体。

外消旋体符号: ±或 dl表示。

例如（±）-乳酸外消旋体的物理性质与纯的单一对映体有一些不同：它无旋光性；熔点、密度等物理常有差异。

将手性碳上的四个原子或基团中最小的 (大多数情况下是氢原子)置于远离我们视线的位置(即放在最远的位置)，然后观察朝向我们的另外三个基团由大到小的顺序。

如为顺时针方向为R构型；反时针方向为S构型。

外消旋体与内消旋体：外消旋体与内消旋体的共同之处是：二者均无旋光性，但本质不同。

外消旋体：是混合物，可拆分出一对对映体。

内消旋体：是化合物，不能拆分。

顺时针旋转：右旋（用“+”表示）逆时针旋转：左旋（用“-”表示）“手性” = “旋光性”手性分子一定存在对映异构体对映异构体也叫“旋光异构体”费歇尔投影式的手性中心，羟基在左侧的为L-型，右侧为D-型。

以甘油醛为标准，手性碳原子上的-OH在右边为D型，-OH在左边为L型。

单一手性物质的获得方法大致有以下三种：!手性源合成法：是以手性物质为原料合成其它手性化合物，这是最常用的方法。

但由于天然手性物质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会遇到很大困难，而且合成路线步骤繁多，也使得产物成本十分高昂。

"不对称合成法：是在催化剂或酶的作用下合成得到过量的单一对映体化合物的方法。

化学不对称合成高旋光收率的反应仍然有限，即使如此，所得产物的旋光纯度对于多数应用仍不够高；生物的不对称合成具有很高的选择性，反应介质通常为稀缓冲水溶液，反应条件温和，但对底物要求高、反应慢、产物的分离困难，因而在应用上也受到一定的限制。

固定化脂肪酶拆分手性化合物本文采用溶胶-凝胶（sol-gel ）固定化技术对本实验室自制的Candida sp. 99-125脂肪酶和Rhizopus arrhizus BUCT-11 脂肪酶进行修饰包埋，并将得到的固定化酶催化拆分手性化合物1-苯乙胺，以期获得高光学纯度的（F0 - 或（S） -N-乙酰-1-苯乙胺。

文中针对脂肪酶的分离纯化与性质，有机相中脂肪酶拆分1-苯乙胺的工艺条件，以及固定化条件对脂肪酶活性和对映选择性的影响三个方面进行了探索和研究。

为了提高脂肪酶的酶活水平，实验采用简单的两步法，即离子交换层析和疏水层析法对Candida sp . 99-125脂肪酶进行了纯化。

该方法简单，便于规模化制备，纯化后脂肪酶的比活提高了10.0倍，达到27200U ・mg^-1, 收率为35.5%。

经等电聚焦电泳分析得到四个同工酶，其分子量约为38kDa,等电点为4〜6。

酶学性质研究表明，纯化酶的最适反应温度为40C，最适反应pH值为8.5。

该酶具有良好的物理稳定性，在20C下放置2d,其酶活收率达95%以上；在23C、pH只8的环境中保存15h,活性可保持在90%以上。

Ca²⁺ 的活化效果最好，可使酶活提高30%以上；Tween8啊Span60可提高该脂肪酶的活性，但幅度不大；而Fe²⁺, Cu²⁺O SDSM其有明显的抑制作用。

有机相中脂肪酶拆分1-苯乙胺的反应条件研究表明，以乙酸乙酯作为反应溶剂和酰基供体，在50C下，190rpm的摇床反应7天，Candida sp . 99-125 脂肪酶可催化44.9%的1-苯乙胺发生转酯化，产物e.e.为10.8%;在Rhizopusarrhizus BUCT-11脂肪酶的催化下底物转化率为50.1 %，产物e.e.为10.5 % 两种脂肪酶的催化拆分效果相似，且对映选择性都不高对溶胶-凝胶法制备固定化酶的方法和条件进行了初步探索。

华东理工大学科技成果——酶法拆分生产（S）-萘普生
项目简介萘普生是一种传统的非处方消炎、镇痛药物。

作为一种手性药物，其（S）-构型化合物的消炎活性是（R）-构型的28倍。

对化学法合成的消旋萘普生进行拆分，得到光学纯的（S）-萘普生，可以有效地提高药效，减少毒副作用。

我们采用自行开发的重组酯酶催化消旋萘普生甲酯的立体选择性水解，（S）-萘普生甲酯水解生成相应的（S）-萘普生，未反应的（R）-萘普生甲酯在强碱环境下进行消旋，得到消旋萘普生甲酯，回收后与新鲜底物混合，重新用于拆分反应。

由于萘普生甲酯在水中溶解性差，与酶接触面积小，反应时底物浓度通常比较低，本项目中，我们采用简单的机械破碎的方法，对底物进行粉碎，获得细微的底物颗粒，极大地增加了萘普生甲酯颗粒的表面积，从而有效地提高了纯水相反应介质中萘普生甲酯的酶促反应速率，底物浓度可达到5%，并且反应结束后通过简单过滤即可实现底物与产物的分离，工艺简单。

所属领域医药
项目成熟度小试
应用前景本项目已在实验室中进行了20L规模的小试，（S）-萘普生的光学纯度高于98%，总收率高于85%。

知识产权及项目获奖情况
相关技术已申请中国发明专利，申请号201010114462.8。

合作方式技术开发。

专利名称：一种酶法拆分手性物质的方法
专利类型：发明专利
发明人：李志刚,苏金芬,杨博,王永华,李振成,陈华勇申请号：CN201811500754.8
申请日：20181210
公开号：CN109628508A
公开日：
20190416
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物工程与食品技术领域，公开了一种酶法拆分手性物质的方法，包括以下步骤：(1)配置脂肪酶浓度为1‑3000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂，配成三液相体系；所述疏水性溶剂中含有消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物；(2)将三液相体系于搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为三层，从上自下依次为上液层、中液层和下液层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层或下液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。

该方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有酶法手性拆分效率低、手性选择性差、回收率低、难于工业化的难题。

申请人：华南理工大学
地址：510640 广东省广州市天河区五山路381号
国籍：CN
代理机构：广州市华学知识产权代理有限公司
代理人：宫爱鹏
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手性芳香胺的酶法拆分戴军强;吴坚平;徐刚;杨立荣【摘要】以芳香酮为原料合成了相应的芳香胺.首次以乙酸异丙烯酯作为酰基供体,在甲苯介质中经Novozym 435酶催化对芳香胺进行拆分,得到了较高转化率和e.e.值的手性芳香胺(S-1和R-2),其中S-3-氯-苯丙胺(S-1e)和R-3-氯-乙酰苯丙胺(R-2e)为新手性化合物.【期刊名称】《合成化学》【年(卷),期】2006(014)005【总页数】3页(P491-493)【关键词】乙酸异丙烯酯;Novozym 435;酶催化;拆分【作者】戴军强;吴坚平;徐刚;杨立荣【作者单位】浙江大学,化学与生物工程学院,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学与生物工程学院,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学与生物工程学院,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学与生物工程学院,浙江,杭州,310027【正文语种】中文【中图分类】O625.63光学活性胺是有机化学中的一类重要化合物，常用作医药、香料、有机合成工业的重要中间体，而光学活性的芳香胺由于其特殊的药理活性被用于合成天然和非天然药物，也用作手性助剂和手性拆分剂[1]。

目前获得光学活性芳香胺的方法有化学拆分法[2]、化学不对称合成法[3]和酶拆分法[1，4]。

其中酶拆分法由于条件温和，反应选择性好而成为优先考虑的方法。

本文首次以乙酸异丙烯酯作为酰基供体，在甲苯介质中经Novozym 435酶催化对芳香胺进行拆分，得到了较高转化率和e.e.值的手性芳香胺(S-1和R-2)，其中S-3-氯-苯丙胺(S-1e)和R-3-氯-乙酰苯丙胺(R-2e)为新手性化合物(Scheme 1)。

CompabcdeR1o-ClC6H4-m-ClC6H4-p-ClC6H4-p-MeOC6H4-C6H5-R2MeMeMeMeCl(CH2)2-Scheme 11 实验部分1．1 仪器与试剂AUTOPOL IV型自动旋光仪(c=1．0，甲醇)；Esquire 3000 plus型质谱仪；Ultra Shield BRUKER 400型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；HP series 1100型高效液相色谱仪(HPLC，Chiralpak AD-H手性柱，检测波长224 nm，流速1 mL·min-1,进样体积5 μL)； GC-950型气相色谱仪。

酶法拆分手性化合物HPBE
张宪锋;郑裕国
【期刊名称】《生物加工过程》
【年(卷),期】2003(001)002
【摘要】R-HPBE(2-羟基-4-苯基丁酸乙酯)是一种重要的医药中间体,可以通过脂肪酶催化水解外消旋体得到.介绍了此催化过程的机理、工艺、产物检测等,并通过酶在疏水载体上的界面吸附对酶进行固定化,以提高酶活及对映选择性.
【总页数】5页(P34-38)
【作者】张宪锋;郑裕国
【作者单位】浙江工业大学,生物与环境工程学院,杭州,310014;浙江工业大学,生物与环境工程学院,杭州,310014
【正文语种】中文
【中图分类】Q814.9
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