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水蛭素对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究

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?水蛭是临床常用的活血药物，能有效治疗器官纤维化

?水蛭是临床常用的活血药物，能有效治疗器官纤维化

水蛭是临床常用的活血药物，能有效治疗器官纤维化纤维化是一种以组织和器官疤痕和硬化为特征的疾病。

当组织在受到感染、机械损伤以及其他的刺激时，坏死的细胞或者入侵的微生物等会共同激活复杂的炎症反应。

急性损伤时，伤口愈合反应通常会得到控制，炎症反应会迅速消退，并且正常组织结构也会恢复。

但是，如果器官经历慢性损伤，伤口愈合反应往往是缓慢的或者处于失调状态，通常会导致病理性纤维化或瘢痕的形成，损害正常组织功能。

图丨来源网络器官纤维化如果不能及时治疗，将会造成器官功能衰竭。

流行病学数据表明，仅肝硬化就影响着全球数亿人口，每年造成上百万人死亡，已成为最常见的死亡原因之一。

而肺纤维化，诊断后平均生存期仅为2.8年，死亡率高于大多数肿瘤疾病，因此被称作一种“类肿瘤疾病”。

目前，药物治疗和器官移植是器官纤维化的主要治疗方法。

器官移植一直存在供不应求的情况，且自体对于移植的器官不可避免的产生排异反应，所以满足不了大部分纤维化疾病患者的需求。

而药物治疗虽然能够延缓疾病的进展，延长患者生存时间，但也不能彻底治愈纤维化疾病。

要破解这一世界难题，仍然需要广大科研人员和医务工作者的努力。

孙学强、张晨光等发布在《淮海医药》的研究报道水蛭抗纤维化临床疗效观察表明：在抗肝硬化中药复方中加用水蛭，有助于提高中药复方合剂抗肝纤维化治疗效果。

水蛭是临床常用的活血药物，其主要成分有水蛭素、肝素、纤溶素等。

现代药理研究证明水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，可通过抑制凝血酶来抑制纤维化的发生发展。

图丨来源网络研究人员选择2006年8月～2007年8月在院感染科住院及门诊就诊的肝郁脾虚型肝硬化患者30例，随机分成2组，每组各15例，分别在药物中加用水蛭和去除水蛭。

干预治疗3个月，观察症状前后变化。

结果两组治疗后肝硬化患者症状均有改善，水蛭治疗组胁肋疼痛症状改善更明显。

治疗前后透明质酸、层粘连蛋白指标有明显差异，水蛭组治疗后血清Ⅲ型前胶原浓度明显降低。

水蛭素对增生性瘢痕基质金属蛋白酶-2、9表达作用的影响

水蛭素对增生性瘢痕基质金属蛋白酶-2、9表达作用的影响

当皮肤损 伤 达 到一 定 深 度 和 范 围 时 ， 织 自然 组 修 复的结 局便 是瘢 痕形 成 。皮肤 创 伤愈合 过程 分 为
炎症 期 、 生期 、 塑 期 。在 重 塑期 ， 增 重 填补 组 织 缺损 的肉芽 组织逐 渐 发 生纤 维 化 ， 富 的胶 原 沉 积伴 胶 丰 原 构型紊 乱 可导致 增 生性 瘢痕形 成 。胶原 本 身是一
（ ｅＦｒ ｆ ｌ ｔ ｏ ｉ ｌｆＧ ａ ｇ ｉ ｄ ａ Ｕ ｉ ｒｔ ， ａ ｎｎ ３ ０ １ Ｐ ．Ｃ ｉａ ｉ ｔ ｆ ｉ ｅ Ｈ ｓ ｔ ｕ ｎ ｘ ｉ ｌ ｎｖ ｓｙ Ｎ ｎ ｉ ５ ０ ２ ， ． ｓＡ ａ ｄ ｐ ａ ｏ ｉ Ｍｅ ｃ ｅ ｉ ｇ ｈｎ ）
中图 分 类 号 ： ２ ２７ Ｒ ８ ．４ 文献标志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ）００ ２ －３ １０ —６ Ｘ（ ０２ ２ －０ ８ ０
量增 加 ， 分别 以 ０ ５Ｕ ｍ ． ／ Ｌ和 １Ｕ ｍ ／ Ｌ组作 用最 明显 ， 与对照组 比较 差异均有 统计学 意义 （ ０ Ｏ ） Ｐ＜ ． １ 。结论
ＭＭＰ・ ｆ ｙ ｅ ｔ ｐ ｉ ｃ ｒａ ｄ ｅ ｐ ｏ ｅ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ｏ ｉ ｄｎ ｏ ｙ ｅ ｔｏ ｈｃ ｓ ａ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｆ ｂ ｏ ｌｓｓ ｗ ｒ ｕ ｕ ｅ ９ ｏ ｐ ｒ ｏ ｈｃ ｓ ａ ｎ ｘ ｌｒ ｃ ａ ｉｍ ｆ ｍ ｉ ｎ ｈ ｐ ｒｒｐ ｉ ｃ ｒ ｈ ｒ ｈ ｔｏ ｓ ｉｒ ｂ ａ ｔ ｅ ｅ ｃ ｈ ｒ ｄ
Ａ ｓｒｃ ： ｊｃｉ Ｔ ｔ ｙｔｅｅｆ ｔ ｆ ｉ ｄｎｏ ｅｅｐｅｓ ｎｏ ｍａ ｉ ｍ ｔ ｌ ｒｔｉａｅ （ ｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅ ｏｓ ｄ ｈ ｆ ｃ ｏ ｒ ｉ ｎｔ ｘ ｒｓ ｏ ｆ ｔｘ ｅａｏ ｏ ｎｓ一 ＭＭＰ２ ｎ ｖ ｕ ｅ ｈｕ ｈ ｉ ｒ ｌｐ ｅ ２ 一 ）ａ ｉ ｆ ｃ ｉ ｉ Ｆ ｍａ ｒ ｔ ｌ ｐ ｏ ｅ ｎ ｓ － ｏ ｕ ｔｉ ｍｅ ａ ｌ ｒ ｔ ｉａ ｅ ２，９ ｏ ｙ ｅａ ｏ ｈ ｃ ｓ ａ ｘ ｏ ｆｈ ｐ ｒ ｐ ｉ ｃ ｒ

水蛭素对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞bFGF及TGFβ_1表达的影响

水蛭素对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞bFGF及TGFβ_1表达的影响
维 细胞分泌 Ｔ ＦＤ ， Ｇ 促进其分泌 ｂＧ 。结论 ： ＦＦ 水蛭素抑 制瘢痕可调节 ｂ Ｇ 、 Ｇ Ｆ Ｆ Ｔ ＦＤ 分泌 ， 由此抑制成纤维细胞 的生长 、 增殖并进 键词］ 瘢痕； 水蛭素； 纤维 细胞； 成 碱性成纤维 细胞生长 因子； 转化生长因子 ｐ
采 用 经 皮给 药 的 方式 ， 以起 到和 内服相 同的 结果 。 可
１ ８ １ Ｏ． ４ —５
［］ ２王常鑫， 杨春伟． 工栽 培虫草的工艺研究和分 析［ ． 人 Ｊ 医药 界，０ ５ ］ ２０， １（） ６７ ． ２１： —８ ７ ［］ ３钟石， 计东风 ， 陈诗等． 虫草 的研究进展 ［ ． 蛹 Ｊ 蚕桑通报，０ ６３ （） ］ ２ ０ ，７４：
２ ９２ ． １ ２１
［ 了克祥． 化皮肤的生物 学特 征及表皮改变 ［ ． ６ ‘ ］ 老 Ｊ 国外医学 ・ ］ 老年医
学册，９ ９ ０ １：６３ ． １ ９， （） —８ ２ ３ ［ 收稿 日期］Ｏ １Ｏ —９ ［ ２ ｌ一１２ 修回 日期］ｏ １０ —４ ２ １ －３ １
［ 考文献］ 参
６ ｌ． 一 ０
【］ ４ 李峰 ， 吴军正， 斌， 动物实验用脱毛剂配方 的改进［］ 刘 等． Ｊｌ 实用 口腔 医学杂 志，９ ８１ （） ２ ８２ ９ １９ ，４ ４ ： ０ —０ ． ［］ ５王倩 ． 延缓皮肤衰老的研究现状【 ． 中药 Ｊ 中国美 容医学， ０ ， （） 】 ２ ６１ ２： ０ ５
ＧＵＯ ＲｕｉＮＯＮＧ Ｘｉｏ ｉ ’ ＤＥ Ｉ ｊ ． ａ —ｌ ． ＮＧ ｉｇ１ Ｉ ａ ｑｕ ｎ， Ｉ ｕ ｓ ａ ４ Ｉ ｎ ｉｇ５ Ｉ ｏ’ ｎ Ｌｎ ， — ａ Ｓ — ｈ ｎｇ， Ｌ Ｊｉ ＬＪ Ｌ Ｙａ —ｎｎ ， Ｌ Ｈａ

成纤维细胞CD90表达与增生性瘢痕形成机理的相关分析的开题报告

成纤维细胞CD90表达与增生性瘢痕形成机理的相关分析的开题报告

成纤维细胞CD90表达与增生性瘢痕形成机理的相关分析的开题报告一、研究背景及意义增生性瘢痕形成是一种常见的临床现象，其特征为瘢痕区域不仅有明显的皮肤色素沉着和纤维连接组织增生，还伴有瘢痕的抬高和硬结，给患者带来极大的心理困扰和身体不适。

虽然瘢痕形成过程中多种细胞类型参与其中，但是成纤维细胞在其中扮演了关键角色。

成纤维细胞是一类分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白等结缔组织成分的细胞，其过度增殖和分泌导致了增生性瘢痕的形成。

而CD90是成纤维细胞表面的一种标志物，也被证明与成纤维细胞的增殖和分泌有关。

因此，通过对成纤维细胞CD90表达与增生性瘢痕形成机理的相关分析，有助于深入了解瘢痕形成的发病机制和瘢痕组织的特点，为瘢痕治疗提供更加有效和精准的参考。

二、研究内容和方法1. 研究内容本研究旨在探究成纤维细胞CD90表达与增生性瘢痕形成机理的相关性，具体研究内容包括：（1）对增生性瘢痕患者瘢痕组织和正常皮肤组织中成纤维细胞CD90表达水平的检测和比较；（2）研究不同CD90表达水平成纤维细胞的生物学特性，如增殖、分泌等方面的差异；（3）探究CD90介导的外泌体与瘢痕形成相关蛋白质间的相互作用机制；（4）研究CD90与其他因子（如TGF-β、IL-6等）在增生性瘢痕形成中的相互作用及其调控网络。

2. 研究方法（1）病例选择：收集30例增生性瘢痕患者的瘢痕组织和正常皮肤组织。

对组织标本进行取样和处理，进行免疫组织化学染色（IHC）或免疫荧光染色(IF)分析。

（2）成纤维细胞培养：分离增生性瘢痕和正常皮肤组织成纤维细胞，分离纯度达到80%以上。

通过流式细胞术(FACS)分离不同CD90表达水平的成纤维细胞子群，研究不同表达水平成纤维细胞的生物特性。

（3）外泌体分离和筛选：采用超速离心法分离成纤维细胞外泌体，利用Western blotting等方法筛选与瘢痕形成相关的外泌体蛋白质，分析其与CD90的相互作用机制。

（4）分子生物学研究：采用RNA干扰或CRISPR-Cas9等方法对CD90或其他瘢痕相关基因进行干预，研究其在增生性瘢痕形成中的作用及其与其他因子的相互影响。

RNAi抑制PTN对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究的开题报告

RNAi抑制PTN对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究的开题报告

RNAi抑制PTN对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究的开题报告一、研究背景和意义增生性瘢痕是一种良性增生性皮肤病变，其特点是瘢痕的扩散性增生和呈现出肥厚、红肿、僵硬和疼痛等严重的症状。

目前尚未发现有效的治疗方法，这严重影响瘢痕患者的生活质量。

因此，寻找有效的治疗手段是非常必要的。

PTN基因是一种与细胞增殖有关的基因，它在肿瘤和瘢痕的增生过程中起到重要的作用。

RNA干扰技术（RNAi）可以针对特定基因进行靶向抑制，已被广泛应用于肿瘤治疗和基因研究中。

因此，基于RNAi技术来抑制PTN基因可能是治疗增生性瘢痕的有效方法。

二、研究目的本研究旨在探究RNAi抑制PTN基因对人增生性瘢痕成纤维细胞（HSSCFs）的作用，以期为瘢痕的治疗提供新的治疗策略。

三、研究内容和方法1.构建RNAi载体基于RNAi技术，设计和构建特异性的RNAi载体，将其引入HSSCFs 中，以实现对PTN基因的靶向抑制。

2. 测定RNAi的效果利用RT-PCR和Western blot技术检测RNAi的效果，包括PTN基因的表达水平和蛋白质表达水平。

3. 测试细胞增殖情况利用MTT实验和细胞增殖生长曲线对HSSCFs的增殖情况进行测定，以确定RNAi抑制PTN后对细胞增殖的影响。

4.分析细胞周期和细胞凋亡利用流式细胞术分析对细胞周期和细胞凋亡的影响，以评价RNAi在HSSCFs中对PTN基因的抑制效果。

四、预期结果通过RNAi技术抑制PTN基因，我们预计在HSSCFs中抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，从而达到对增生性瘢痕的治疗效果。

五、结语本研究预计通过RNAi技术抑制PTN基因，探究其在HSSCFs中对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的作用，以期为治疗增生性瘢痕提供新的治疗思路。

天然水蛭素对肌腱成纤维细胞抑制作用的体外研究

天然水蛭素对肌腱成纤维细胞抑制作用的体外研究

天然水蛭素对肌腱成纤维细胞抑制作用的体外研究曾林如;汤样华;王楠【期刊名称】《中国医学创新》【年(卷),期】2018(015)005【摘要】目的:通过体外实验研究天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞的抑制作用及三种相关细胞因子表达水平的变化,揭示天然水蛭素预防肌腱粘连的作用及相关途径.方法:体外分离培养兔肌腱成纤维细胞,采取MTT法检测不同浓度天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞增殖活性的影响;运用ELISA法测定兔肌腱成纤维细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达含量.结果:与未加水蛭素组(0 U/mL)比较,天然水蛭素干预组(1.50、3.00、6.00 U/mL)能够显著抑制兔肌腱成纤维细胞生长;并正向调节bFGF与MMP-2含量表达,负向调节TGF-β1含量表达(P<0.05或<0.01).结论:天然水蛭素能够显著抑制体外培养的兔肌腱成纤维细胞的增殖,且具有一定的浓度依赖性;通过降低兔肌腱成纤维细胞TGF-β1的表达并相应提高bFGF与MMP-2的表达可能是其基于TGF-β1/Smads信号通路发挥抗纤维化作用的一种有效途径.【总页数】4页(P9-12)【作者】曾林如;汤样华;王楠【作者单位】杭州市萧山区中医院浙江杭州 311201;杭州市萧山区中医院浙江杭州 311201;杭州市萧山区中医院浙江杭州 311201【正文语种】中文【相关文献】1.水蛭素对瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶作用的实验研究 [J], 李开通;刘达恩;李顺堂;鲁海强;陈晓婷;高兴新2.水蛭素对牙龈成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1表达的影响 [J], 郑怡;禤坤;南澜;莫水学3.水蛭素对压应力作用下牙龈成纤维细胞胶原纤维Ⅰ和基质金属蛋白酶1表达的影响 [J], 王瑶;覃昌焘;马琴琴;郑怡;莫水学4.A型肉毒毒素对兔肌腱成纤维细胞抑制作用的实验研究 [J], 许良;王楠;曾林如5.中国天然水蛭素之父——水蛭素科技创新领军人周维海的毕生追求 [J], 曹福成;燕利娜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

水蛭素活性因子抗癌作用的实验研究

见表 １
１ ． ２ ． １水 蛭 素活性 因子对 Ｈ ２ ２肝癌 瘤 细胞 的影 响 １ ． ２ ． １ ． １肿 瘤 接 种造 模 选 择 腹 腔 接 种 Ｈ ２ ２肝 癌 实 体 瘤株后 ６ － ９ ｄ 、 生 长 良好 的 Ｈ２ ２肝 癌 小 鼠 ， 放 置 于 超 净工作台 ， 腹 部皮 肤 消 毒后 打 开 小 鼠腹 腔 ， 抽取乳 白 色 瘤液 ．用 生 理盐 水 配制 成 含瘤 细胞 ２ ￣ １ ０ ｑ ｍ Ｌ的 细 胞 悬液 。 选取 ４ ８只小 鼠 ， 每只小 鼠左 前腋 下皮肤 消 毒 后 ，接种 Ｈ２ ２肝 癌瘤 细胞 悬 液 ０ ． ２ ｍ Ｌ ，次 日开 始 给
１材 料 与 方 法
１ ． １材 料
１ ． ２ ． ２ ． ２动 物 分组 与 用 药 将 接种 瘤 细胞 后 的 ４ ４只小 鼠， 随机法 分成 ４组 ， 每组 １ １ 只： 模型对 照组 、 ５ 一 Ｆ Ｕ 组、 水蛭 素活性 因子大 、 小 剂量组 。 模型对 照组 给予 同体积 的生 理盐 水 ； ５ 一 Ｆ Ｕ组给予 ５ 一 Ｆ Ｕ ０ ． １ ５ ｇ ／ ｋ ｇ ； 水 蛭 素大 、
１ ． １ ． ２细胞 株
１ ． １ ． １动物
天平 上称 瘤 重 ，计 算抑 瘤率 ： （ Ｃ — Ｔ ） ／ Ｃ ｘ １ ０ ０ ％（ Ｃ为模 型对 照组 平均 瘤 重 ， Ｔ为 给药 组平 均瘤 重 ） ； 比较各 组 肿 瘤生 长情 况 ： 在实验 过 程 中严密 观察 小 鼠的精神 状 态、 活动、 毛发 、 饮食等 。
小 剂 量 组 分 别 给 予 水 蛭 素 活性 因 子 ２ ． ６ ０ 、 １ ． ３ ０ ｋ ｇ 。 昆明种 健康 、 雄性 小 白鼠 ， 体重（ ２ ２ ． ０ ￣ ０ ． ５ ） ｇ ， 由山 ４ ４只小 鼠每 日灌 胃 １ 次， 每次 ０ ． ５ ｍＬ ， 连 续给 药 １ ４ ｄ ， 东 省实 验动 物 中心 提供 ，医学 实验 动物 合格 证号 ： 动 于第 １ ５天 脱颈 椎处 死小 鼠 ， 剥离 瘤块 ， 将 瘤块 置 扭力 管 质字 （ ２ ０ ０ ８ ） 第０ １ ７ ９号 。

水蛭素对瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶作用的实验研究

水蛭素对瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶作用的实验研究目的：探讨水蛭素对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达水平的影响。

方法：取10例烧伤愈合后6个月内瘢痕挛缩需手术治疗的患者的瘢痕组织，采用组织块法分离培养增生性瘢痕成纤维细胞。

取第4～7代细胞实验，加入0、1、10、50U/ml的水蛭素干预。

观察加药后24h、48h成纤维细胞形态学变化，利用MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法及酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblast，HSFB）及基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的作用。

结果：①1、10、50U/ml组水蛭素对HSFB 均有抑制作用（P＜0.05），以50U/ml作用最明显（24h、48h抑制率分别为14.75%、15.42%）；②水蛭素作用成纤维细胞24h后MMP-2、MMP-9表达含量均增加，分别以1U/ml、50U/ml作用最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；48h后MMP-2表达降低,MMP-9表达有增加但无意义。

结论：水蛭素能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，能促进增生性瘢痕成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（MMP-2,MMP-9）有利于细胞外基质降解减少沉积。

Abstract: Objective To explore the effect of hirudin on the expression of matrix metalloproteinases of the human hypertrophic scar fibroblast. Methods 10 cases of hypertrophic scar tissue were taken from the operated patients who were within 6 months after injury . Fibroblasts of hypertrophic scar tissue were cultured by tissue block method. The cells after 4～7generations were used in experiments, which were interfered with exposure to 0U/ml,1U/ml,10U/ml or 50U/ml hirudin for 24 and 48 hours. We detected the effect of hirudin on the proliferation of fibroblasts by MTT method and the expression of MMP-2,MMP-9 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results ①Hirudin could inhibit the proliferation of scar fibroblasts in the group of 1,10,50U/ml(P＜0.05).The effect of inhibition of hirudin with 50U/ml was most significant(the inhibition rates of 24,48hours were 14.75% and 15.42%). ②The level of expression of MMP-2 and MMP-9 was increased with the role of hirudin on fibroblasts after 24h,especially it was most significant with 1U/ml and 50U/ml.The difference was statistically significant (P＜0.05).After 48hours the expression of MMP-2 was decreased,meanwhile the expression of MMP-9 was increased but no significance. Conclusion Hirudin can inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts,promote the secretion of matrix metalloproteinases (MMP-2, MMP-9) by hypertrophic scar fibroblasts and will help to promote the degradation and reduction of the extracellular matrix.Key words:hirudin;hypertrophic scar;matrix metalloproteinases皮肤损伤尤其是深度烧伤愈合后出现的增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）不但影响美观，严重者还可造成局部畸形或功能障碍。

中药水蛭素的实验研究

中药水蛭素的实验研究作者：陈建衡等来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第08期【摘要】目的：研究和探讨中药水蛭素的药理作用，为临床开发应用提供理论依据。

方法：取小鼠和大鼠，随机分模型对照组、中药水蛭素大剂量组、中药水蛭素小剂量组，连续灌胃给药6-15天。

单核细胞吞噬活性实验，小鼠腹腔注射0.5%的鸡红细胞悬液，取腹腔洗液，电热恒温水浴箱中孵浴，丙酮、甲醇液固定，染色，油镜下观察单核细胞吞噬鸡红血球的数目。

足跖肿胀抑制实验，最后一次给药1h后，于大鼠右后跖腱膜下注入1%角叉菜胶，分别测定致炎后不同时间内足跖肿胀程度。

结果：各用药组与模型对照组相比较，具有显著性差异。

结论：中药水蛭素能明显提高小鼠单核细胞的吞噬活性，具有促进细胞免疫的作用，同时水蛭素对角叉菜胶致炎的大鼠足跖肿胀具有较强的抑制功效。

【关键词】中药水蛭素；单核细胞吞噬活性；足跖肿胀水蛭的应用在我国已有两千多年的历史，是传统医药中经典的活血化瘀中药，为环节动物水蛭科蚂蟥宽体金线蛭（Whitmania pagra Whitman）的全体，其主要有效成分是水蛭素，广泛用于临床治疗各种疑难病症，且无明显的毒副作用。

为了更深入的开发中药水蛭素的药理作用，我们对该药进行了基础实验研究，现报告如下。

1 实验材料1.1 动物：昆明种健康小白鼠，雄性，体重20±0.5g，合格证号：动管质字（2010）第189号，山东省动物实验中心提供。

Wistar大白鼠，雄性，体重150±5g，合格证号：动管质字（2010）第256号，山东省动物实验中心提供。

1.2 药品：中药水蛭素，山东省医学科学院中医药实验室提供。

1.3 试剂：丙酮溶液（分析纯），甲醇溶液（化学纯），山东新华制药总厂生产，批号20100802。

角叉菜胶，广东宏发试剂有限公司生产，批号20090819。

1.4仪器：双目电子显微镜，江苏南京医疗器械公司生产。

精密扭力天平，山东永远科技公司生产。

水蛭素对压应力作用下牙龈成纤维细胞胶原纤维Ⅰ和基质金属蛋白酶1表达的影响

水蛭素对压应力作用下牙龈成纤维细胞胶原纤维Ⅰ和基质金属蛋白酶1表达的影响王瑶;覃昌焘;马琴琴;郑怡;莫水学【摘要】目的:研究压应力对人牙龈成纤维细胞(HGFs)生物学行为的影响及不同浓度水蛭素对压应力作用下HGFs胶原纤维I(COL-I)和基质金属蛋白酶1(MMP 1)表达的影响.方法:建立HGFs压应力作用模型,MTT法检测压应力对细胞增殖活性的影响.采用RT-qPCR和ELISA两种方法检测不同压应力作用下的HGFs及不同浓度水蛭素作用下的HGFs受力后COL-I、MMP-1的表达.结果:3 g/cm2力值刺激细胞增殖效果最为显著(P＜0.05).压应力作用HGFs后,上调COL-I和下调MMP-1的表达(P＜0.05).水蛭素作用压应力刺激的HGFs后,可抑制COL-I和促进MMP-1的表达(P＜0.05).结论:压应力刺激促进HGFs增殖,影响牙龈组织细胞外基质(ECM)的代谢.水蛭素抑制ECM胶原的沉积,促进胶原的降解,进而促进正畸牙移动过程中牙龈的改建.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2016(033)002【总页数】5页(P243-247)【关键词】水蛭素;人牙龈成纤维细胞;胶原纤维Ⅰ;基质金属蛋白酶1【作者】王瑶;覃昌焘;马琴琴;郑怡;莫水学【作者单位】广西医科大学附属口腔医院正畸科南宁 530021;广西医科大学附属口腔医院正畸科南宁 530021;广西医科大学附属口腔医院正畸科南宁 530021;广西医科大学附属口腔医院正畸科南宁 530021;广西医科大学附属口腔医院正畸科南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R783.5正畸治疗时，常可观察到牙龈受压、堆积、退缩、内陷或形成裂隙等情况，由于其塑建缓慢，常影响正畸牙移动(orthodontic tooth movement，OTM)的速率及矫治效果的稳定性[1]。

本课题组将水蛭素抑制增生瘢痕的作用和影响引入正畸牙龈改建的研究中。

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广西医学 2011 年 3 月第 33 卷第 3 期
261
水蛭素对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究▲
张 奇 刘达恩 王家瑞 农庆文 李开通 梁坤兰
（ 广西医科大学第一附属医院烧伤整形科，南宁市 530021）
【摘要】 目的 探讨水蛭素对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞（ HSFb） 凋亡的作用。方法 分离培养 HSFb 取 4 ～ 7 代细胞实验。分别采用免疫细胞化法及 Western blot 法检测不同浓度水蛭（ 0 ml、0． 25 ml、1． 00 ml） 对 HSFb、Bax、Bcl-2 基因表达的影响。结果 水蛭素对 HSFb 的增殖有抑制作用； 免疫组化实验及 Western blot 法 检测均表明： 水蛭素能增加 Bax 表达，抑制 Bcl-2 表达，和对照组比较差别有统计学意义（ P ＜ 0． 05） 。结论 实验 浓度水蛭素对 HSFb 有显著的抑制作用。
1 材料与方法
1． 1 实验材料器械 水蛭素（ 广西医科大学实验中 心） ，20% DMEM 培养基（ 美国 Gibco 公司） ，胎牛血 清（ 杭州四季青生物材料研究所） ，四甲基偶氮唑盐、 EDTA（ 美国 Amersco 公司） ，小鼠抗人 Bcl-2、Bax 单 克隆抗体（ 美国 Santa Cruz 公司） ，Western blot 检测 试剂盒（ 武汉博士德公司） ，Bax、Bcl-2 抗体、S-P 超敏 试剂盒、DAB 显色液（ 福建迈新生物技术开发有限公 司） 。倒置光学显微镜（ 日本 Olympus 公司） ，电子天 平（ 美国 PTAST 公司） ，96 孔培养板（ 加拿大 Biofil 公 司） ，电泳槽、凝胶成像系统（ 美国 Bio-Rad 公司） 。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 标本收集： 2009 年 6 ～ 12 月在广西医科大学进
【Key words】 Hypertrophic scar； Hirudin； Fibroblast； Bax； Bcl-2
增生性瘢痕（ hypertrophicscar，HS） 是创伤后，尤其 是深度烧伤后最常见的一种病理性愈合现象，其本质 是成纤维细胞（ fibroblast，FB） 的异常增殖和细胞外基 质的过度沉积。目前尽管对增生性瘢痕的发病机制和 治疗手段进行了大量研究，但仍没有理想的结果。因 此寻求有效防治增生性瘢痕的方法是创伤修复领域的 重要课题。经研究表明水蛭素具有抑制器官纤维化、 抗炎等作用［1］。本实验在体外培养增生性瘢痕成纤维 细胞（ hypertrophic scar fibroblast，HSFb） 后加入不同浓 度的水蛭素，通过观察细胞形态、免疫细胞化学染色 及 Western blot 法检测 HSFb 中 Bax 和 Bcl-2 的表达， 探讨水蛭素对体外培养的 HSFb 凋亡的作用，为临床 治疗 HS 提供理论依据。
【关键词】 增生性瘢痕； 水蛭素； 成纤维细胞； Bax； Bcl-2 【中图分类号】 R 282． 74 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304（ 2011） 03-0261-04
Effect of Hirudin on Human Hypertrophic Scar Fibroblast
图 2 水蛭素对 Bcl-2 蛋白 Western blot 图
广西医学 2011 年 3 月第 33 卷第 3 期
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3讨论
水蛭素是 1884 年 Haycraft［2］首先在水蛭的提取 物中发 现 的 一 种 含 有 抗 凝 血 作 用 的 物 质，它 是 由 65 ～ 66个氨基酸组成的小分子蛋白质。水蛭素肽链 中部有一个由 Pro-Lys-Pro 组成的特殊序列，不被一 般蛋白酶降解。水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成， 并能阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应 等瘀血现象，能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖 和凝血酶 对 内 皮 细 胞 的 刺 激。 与 肝 素 相 比，它 用 量 少，不会引起出血，也不依赖内源性辅助因子； 而肝素 则有引起出血的危险，在弥散性血管内凝血的发病过 程中抗凝血 酶 Ⅲ 往 往 减 少，这 将 限 制 肝 素 的 应 用 范 围。因此，水蛭素是一种很有前途的抗凝化瘀药物， 可用于治疗各种血栓性疾病，尤其是静脉血栓和弥漫 性血管凝血，还可用于预防手术后及溶解血栓后或血 管再造后血栓的形成，改善体外血液循环和血液透析 的过程。
【Abstract】 Objective To explore the effect of hirudin on the apoptosis of the human hypertrophic scar fibroblast （ HSFb） cultivated in vitro． Methods Experiment of isolate cultivating HSFb and cells after 4 － 7 generations were used in subsequent experiments． The expression of Bax and Bcl-2 in HSFb were analyzed by Western blot． Results Hirudin had an inhibitive effect on the proliferation of HSFb； Immunohistochemistry and Western blot results showed that hirudin increased the expression of Bax，but inhibited the expression of Bcl-2，compared with the control group，the difference was statistically significant （ P ＜ 0． 05） ． Conclusion Hirudin of experimental concentration has significant inhibitory effects on HSFb．
集、呈平行极性排列，细胞晕清晰，形态规则，有扁平
而长的突 起。 用 药 组 随 药 物 浓 度 加 大，细 胞 间 隙 增
宽，细胞缩小，突起缩短，细胞变圆，胞浆减少，胞核模
糊。 2． 2 免疫组化染色法检测成纤维细胞中 Bax、Bcl-2
基因所产生的蛋白 水蛭素浓度为 0 ml、0． 25 ml、 1 ml时，随着水蛭素浓度的升高，Bax 基因蛋白表达 逐渐增加，Bcl-2 基因蛋白表达逐渐降低，组间比较差 异有统计学意义（ P ＜ 0． 05） ，见表 1。
▲基金项目： 广西科学基金（ 桂科自 0728110） 通信作者： 刘达恩（ 1962 ～ ） ，男，硕士研究生，主任医师，教授。研究方向： 大面积烧伤抢救与治疗，难愈性创面修复，疤痕的预防 和治疗。E-mail： liudaen@ 126． com
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Guangxi Medical Journal，Mar． 2011，Vol． 33，No． 3
行手术切除的 12 例烧伤后增生性瘢痕组织标本（ 12 块） ，其中男 5 例，女 7 例； 年龄 1． 5 ～ 24（ 8． 8 ± 7． 6） 岁； 上肢 5 例，下肢 3 例，躯干 3 例，颜面部 1 例。患者均 无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，无 心、肺、肝等 慢 性 疾 病，近 期 未 使 用 类 固 醇 激 素 类 药 物、抗肿瘤药物。临床表现为瘢痕处为增生活跃期， 外观发红充血、质硬、高于皮面，瘢痕增生局限于皮损 区内，局部伴瘙痒或疼痛等不适。 1． 2． 2 人增生性瘢痕成纤维细胞的培养及分组： 按 常规培养人增生性瘢痕成纤维细胞并反复传代，选取 4 ～ 7 代成纤维细胞，用 0． 25% 胰酶 + EDTA 消化细 胞后用不含胎牛血清的 DMEM 培 养 液 配 成 密 度 为 5 × 104 的 单 细 胞 悬 液。水 蛭 素 用 不 含 胎 牛 血 清 的 DMEM 培养基稀释其浓度为 1 ml、0． 25 ml、0 ml。从 每个单细胞悬液中取 15 个样品，分为 5 组，每组加上 述 3 个不同浓度的水蛭素。其中一组用于细胞形态 学检查，两组用于免疫组化染色法检测成纤维细胞中 Bax、Bcl-2 基因所产生的蛋白，两组用于 Western blot 法检测水蛭素对 Bax、Bcl-2 基因表达的影响。 1． 2． 3 细胞形态学检查一组加药 48 h 后在显微镜 下观察 HSFb 细胞形态学变化。 1． 2． 4 免 疫 组 化 染 色 法 检 测 成 纤 维 细 胞 中 Bax、 Bcl-2基因产生的蛋白： 两组分别加入已稀释的小鼠 抗人 Bax、Bcl-2 单克隆抗体，加入相应的二抗。利用 HPLAS1000 高清晰度彩色病理图像分析系统，显微 镜下随机选取 3 个视野，以细胞质内出现棕黄色颗粒 者判定为阳性，对成纤维细胞胞浆内 Bax、Bcl-2 的特 异性染色进行图像分析，并使用 Imagepro-Plus 软件 对免疫组化图片进行灰度分析，从而判断水蛭素对成 纤维细胞的影响。 1． 2． 5 Western blot 法检测水蛭素对 Bax、Bcl-2 基因 表达的影响： 两组培养 2 ～ 3 d 后蛋白裂解液裂解、离 心，上层液垂直电泳后转移到 PVDF 膜上，加入相应的 一抗、二抗，在暗房内用显色剂显影、定影、分析。使用 Bio-Rad 扫描仪对 X 光胶片上的条带进行灰度扫描，以 Bax 基因以及 Bcl-2 基因的 0 ml、0． 25 ml、1 ml与内参 样品灰度值相比，灰度值使用 Quantity One 4． 5 软件 系统进行分析。 1． 3 统计学分析 采用 SPSS 16． 0 统计软件进行数 据分析，计量资料均采用x ± s 表示，组间计量资料比 较采用成组设计的方差分析，以 P ＜ 0． 05 为差异有 统计学意义。
表 1 水蛭素对瘢痕成纤维细胞
Bax、Bcl-2 表达的影响（ x ± s，n = 5）
浓度（ ml） 0