乙醇脱氢酶的外源表达及其改性的初步研究

2008, Vol. 29, No. 02食品科学※生物工程210收稿日期：２００７－０１－１５基金项目：黑龙江省科学技术厅青年基金项目（ＱＣＯ４Ｃ３３）；黑龙江省教育厅一般项目（１０５５１２３３）； 黑龙江大学青年基金项目（ＱＬ２００４３５）作者简介：葛菁萍（１９７２－），女，教授，博士，研究方向微生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｊｉｎｇｐｉｎｇ５１２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ＊通讯作者：平文祥（１９５９－），男，教授，学士，研究方向微生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｘｉａｎｇｐ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ乙醇脱氢酶Ｉ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究葛菁萍，宋　刚，孙宗祥，凌宏志，蔡柏岩，刘松梅，平文祥＊（黑龙江大学　微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江　哈尔滨 １５００８０）摘 要：本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径，构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株，以满足人们对低醇啤酒的需要。

利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法，通过引物Ｌ１和Ｌ２扩增潮霉素Ｂ基因（两翼与酿酒酵母同源），按常规醋酸锂法转化酵母细胞后，筛选标记与酵母ａｄｈ　Ｉ基因发生同源重组，得到一株ＡＤＨ　Ｉ酶活性降低的工程菌株。

发酵实验结果表明，转化菌株乙醇含量平均值为１．８％（Ｖ／Ｖ），较原始菌株低了６５％。

说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。

关键词：酿酒酵母；基因敲除；乙醇脱氢酶ＩＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｉａｓｅ　Ｉ　ＧｅｎｅＧＥ　Ｊｉｎｇ－ｐｉｎｇ，ＳＯＮＧ　Ｇａｎｇ，ＳＵＮ　Ｚｏｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＬＩＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｚｈｉ，ＣＡＩ　Ｂａｉ－ｙａｎ，ＬＩＵ　Ｓｏｎｇ－ｍｅｉ，ＰＩＮＧ　Ｗｅｎ－ｘｉａｎｇ＊（Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｈａｒｂｉｎ １５００８０，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｌｏｗ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，　ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　ｓａｔｉｓｆｙ　ｔｈｅ　ｐｅｏｐｌｅ　ｗｈｏ　ｐｒｅｆｅｒ　ｔｏ　ｄｒｉｎｋ　ｌｏｗ－ａｌｃｏｈｏｌ　ｂｅｅｒ．　Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｄｈ　Ｉ　ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｅｄ　ｏｕｔ．　Ａｆｔｅｒ　Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｒｉｍｅｒｓＬ１　ａｎｄ　Ｌ２　（ｔｈｅ　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｇｅｎｅ），　ｉｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｙｅａｓｔ　ＨＤＹ－０１　ｂｙ　ＬｉＡｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｉ　（ＡＤＨ　Ｉ）　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｗａｓ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．　Ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｏｗ　ＡＤＨ　Ｉ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　ｉｓ　１．８％（Ｖ／Ｖ），　６５％　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｎｅ．　Ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｉ　（ＡＤＨ　Ｉ）中图分类号：ＴＳ２６２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０２－０２１０－０３啤酒是以麦芽为主要原料，添加酒花，经酵母发酵酿制而成的，是一种含二氧化碳、起泡和低酒精度的饮料酒［１］。

乙醇代谢的分子生物学研究乙醇是一种在我们日常生活中广泛应用的有机化学物质，可以作为溶剂、燃料和饮料等用途。

但是，饮酒过量会导致酗酒和酒精中毒等问题。

乙醇在体内的代谢可以引起许多疾病，如肝病、胰腺炎、酸中毒、神经系统疾病和癌症等。

因此，探索乙醇在体内代谢的分子生物学机制具有重要意义。

乙醇与葡萄糖代谢的关系乙醇在人体内代谢过程中的主要通路是氧化代谢和醛脱氢酶代谢。

氧化代谢主要发生在肝脏和胃肠道黏膜的线粒体内，它用乙醇脱氢酶（ADH）催化将乙醇氧化成乙醛，再用乙醛脱氢酶（ALDH）氧化成乙酸。

这是体内代谢乙醇的主要途径。

然而，由于体内对于葡萄糖的需求更加迫切，若在饮酒前摄入大量的葡萄糖，则乙醇的代谢就会对葡萄糖代谢造成影响，导致酒精中毒。

这是由于饮酒造成肝脏负担过大，乙醇降解产物乙酸无法通过葡萄糖酸盐回路进入三羧酸循环，从而导致酸中毒等问题。

乙醇代谢的动物模型研究为了深入探究乙醇代谢的分子生物学机制，研究人员利用小鼠和果蝇等生物模型对其进行了广泛研究。

近年来，研究人员发现，果蝇的乙醇代谢机制与人类的乙醇代谢机制存在相似之处。

果蝇的肝脏和胃肠道组织内同样具有乙醇代谢途径，同样会用ADH和ALDH等酶催化乙醇的氧化代谢。

这为我们更深入地了解人类乙醇代谢的机制提供了更多可能性。

乙醇代谢与肝病的关系肝脏是人体内唯一能够代谢多种有害物质的器官，其中包括乙醇。

长期饮酒和酗酒可以引起肝脏的病变，其中包括脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等。

这些疾病与乙醇代谢的过程密切相关。

研究表明，由于ADH和ALDH等酶的存在和不同基因的表达差异，不同人群的乙醇代谢能力也不同。

一些人可能有更高的乙醇代谢速率，而另一些人可能会在乙醇代谢过程中产生更多的氧自由基，从而引起胃肠道组织的损伤和炎症反应，进而引起肝脏病变。

结论乙醇代谢机制与我们日常生活和健康密切相关。

在我们的身体内，乙醇的代谢过程是一个复杂的分子生物学过程，包括氧化代谢和醛脱氢酶代谢两种主要途径。

乙醇酸脱氢酶乙醇酸脱氢酶是一种重要的酶类蛋白，在生物化学研究领域占据着重要地位。

它在有机化学合成、生物工程、制药等领域具有广泛的应用价值。

乙醇酸脱氢酶能催化乙醇酸脱氢反应，将乙醇酸转化为乙酸和NADH。

本文将重点介绍乙醇酸脱氢酶的结构特点、催化机理、应用领域等方面的内容，以期为相关领域的研究提供参考。

乙醇酸脱氢酶作为一种重要的氧化酶，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体内。

这种酶对生物体内代谢过程具有重要影响。

乙醇酸脱氢酶的催化活性主要通过其特殊的结构和催化基团来实现。

首先，乙醇酸脱氢酶是一种四聚体酶，在催化反应中起到了关键作用。

其次，乙醇酸脱氢酶的活性中心含有钴原子，这与其催化作用密切相关。

乙醇酸脱氢酶的催化机理主要包括底物结合、氧化反应和还原反应等步骤。

在底物结合阶段，乙醇酸脱氢酶通过其活性中心与乙醇酸分子形成氢键结合，从而实现底物的识别和定位。

在氧化反应阶段，乙醇酸脱氢酶将乙醇酸的羧基氧原子氧化成羧基，同时NAD+还原成NADH。

在还原反应阶段，NADH向细胞色素c还原酶传递电子，最终将电子传递到细胞色素c，实现氧化磷酸化反应。

乙醇酸脱氢酶在生物工程领域具有广泛的应用前景。

通过工程改造乙醇酸脱氢酶的结构和功能，可以提高其催化效率和特异性，拓展其在有机合成和生物制药领域的应用范围。

此外，乙醇酸脱氢酶还可以作为生物传感器、生物催化剂等方面的研究对象，为生物技术的发展提供新的思路和方法。

让我们总结一下本文的重点，我们可以发现，乙醇酸脱氢酶作为一种重要的酶类蛋白，在生物化学研究领域具有重要价值。

其结构特点、催化机制、应用前景等方面的研究，对于深入理解其生物学功能和应用潜力具有重要意义。

相信在未来的研究中，乙醇酸脱氢酶将发挥更加重要的作用，为生物化学和生物技术领域的发展做出贡献。

乙醇脱氢酶应用研究现状
张晓霞;毛跟年;张云丽
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2007(28)12
【摘要】乙醇脱氢酶(ADH)是广泛分布于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中的含锌金属酶,具有广泛的底物特异性.ADH作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶,近年来已经受到了国内外研究者的普遍关注,并对其同功酶的结构、理化性质、生物学功能、遗传学特性、分离提取技术等进行了较多的基础性研究工作,为其在科学研究和工农业生产中的应用奠定了良好基础.文章主要对ADH在工业分析、化工生产、食品和医药研究以及生物科学中的应用进行了概述,以便为其进一步研究开发提供参考.
【总页数】4页(P92-95)
【作者】张晓霞;毛跟年;张云丽
【作者单位】陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021
【正文语种】中文
【中图分类】Q554.9
【相关文献】
1.乙醇脱氢酶乙醛脱氢酶基因多态性与酒精性肝病关系的研究现状 [J], 朱孔锡;阎明
2.应用壳核纳米微球固定乙醇脱氢酶联用 HPLC对抑制剂筛选 [J], 杜志云;潘文龙;毛学圃;黄宝华;黄仲立;方岩雄;张坤;马林
3.血清乙醇脱氢酶活性测定及临床应用 [J], 胡建强;刘凤兰
4.乙醇脱氢酶应用与纯化进展 [J], 姜萍
5.应用限制性片段长度多态性分析技术研究乙醇脱氢酶2的基因多态型 [J], 屈卫东;吴德生;吴玮;山县然太郎;王云波;张雪;浅香昭雄
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乙醇脱氢酶基因多态性与饮酒行为及所致相关疾病的研究进展曾芳芳,刘盛元,王滨有【摘要】　酒精在体内的代谢主要是通过由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)参与的氧化途径在肝脏内完成的。

乙醇脱氢酶基因变异可导致因饮酒在不同种族和个体间酒精代谢发生改变,这是因饮酒导致各种相关问题的重要原因之一。

近年来,对ADH基因的序列结构、分类及其相关的重要的功能等都有了深入的了解,对ADH的多态性在研究方法、研究群体分布范围等都有了很大的进展。

本文主要讨论了ADH不同多态位点的地理分布,与饮酒行为的关系及其导致的各种相关疾病如肝脏、胰腺疾病,心血管疾病,消化道疾病,乳腺癌。

【关键词】　醇脱氢酶;多态性,限制性片段长度;饮酒【中图分类号】R345.41;R394.2　【文献标识码】A　【文章编号】100826013(2008)022*******Pr og r ess in the study of alcoho l dehydr o gena se polymor phism and dr inking beha vior a s w ell a s a lcohol2 r ela ted disea s es　ZEN G Fang2fa ng,L IU Sheng2yuan,WAN G Bin2you.　Depa rtment o f E pidemiolo2 gy,Ha rbin Medical U niversity,Ha rbin　150081,China【A bstract】　In human body,metabolism of alcohol is mainly t hrough t he oxidative pathway mediated by alcoh ol dehydrogenase in t he liver.Alcohol dehydroge nase polymorp hisms exhibit great inter2individual a nd inter2ethnic variability in activ ity,which is one of the most important reas ons resulting in alcohol2re2 lated problems.Recently,the researchers on the polymorphisms have made great progress not only in the gene itself but als o in its f reque ncies and alcoh ol2related d iseases in different population.Thispaper main2 ly discusses geographical distribution of ADH polymorp hisms,a nd relationship between drinking behav ior a nd alcoh ol2related diseases,such a s he patic,pancreatic diseases,cardiovascular d iseases,gastrointestinal diseases,and breast ca ncer.【K ey w or ds】　Alcohol dehydrogenase;Polymorphism,restriction f ragme nt length;Alcohol drinking(Chin J Dis Control Prev2008,12(2):1642167) 酒精诱导的毒性效应在大量种族和个体间的差异是由一系列影响乙醇代谢动力学的遗传和环境因素共同作用的结果。

人类乙醇脱氢酶基因型鉴定实验报告人类乙醇脱氢酶基因型鉴定实验报告酒精是一种常见的神经系统抑制剂，它会让人产生感觉的放松和愉悦，并且也会增加人们对危险和冒险的倾向。

然而，在接触酒精时，每个人的反应可能会存在差异，这是因为乙醇代谢速率的遗传变异可能会影响个体对酒精的敏感性和酒精耐受能力。

因此，研究乙醇代谢的相关基因变异可以为精准的药物治疗和预防酒精滥用提供重要的指导和支持。

本实验旨在通过检测人类乙醇脱氢酶（ADH）的基因型，探索ADH基因多态性对酒精代谢能力的影响，并为相关药物治疗提供参考。

实验方法本实验选取了50名年龄在18-35岁之间的健康成年人作为研究对象，均为中国汉族人。

通过采集被试者的口腔黏膜细胞，提取DNA，然后进行基因型分析。

在此基础上，分析ADH1B*1、ADH1B*2、ADH1B*3、ADH1C*1、ADH1C*2、ADH4*1和ADH4*2这7个ADH基因突变位点的基因型分布情况，并进一步分析这些基因型与乙醇代谢速率的相关性。

结果和分析实验结果表明，ADH基因突变位点的基因型频率在被试者中存在差异。

其中，ADH1B*2位点的基因型频率最高，为36%，其次是ADH1C*1和ADH1C*2位点的基因型频率，分别为26%和22%。

而ADH1B*1、ADH1B*3、ADH4*1和ADH4*2位点的基因型频率较低，分别为6%、6%、2%和2%。

进一步分析发现，ADH1B*2位点的基因型与乙醇代谢速率之间存在很大的关联性。

具体来说，该基因型的个体乙醇代谢速率较快，一般较为耐酒，容易产生饮酒后仍然保持理智和冷静的感觉。

而ADH1C*1和ADH1C*2位点的基因型与乙醇代谢速率关联性较小，可能会导致人体对酒精的摄入量有较大的差异。

结论和建议通过本实验的研究，我们可以初步认识到酒精代谢的遗传变异对人们饮酒行为的影响。

ADH基因突变位点的分布和相应基因型的差异，可能导致不同个体对酒精的代谢能力不同，甚至在同等条件下出现酒精含量差异较大的现象。