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废啤酒酵母制取酵母抽提物的酶促工艺研究吴满刚;雷姝敏;卞君杰;费立天;于海;葛庆丰;姜虹;周平凡【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2016(032)008【摘要】为了获得废啤酒酵母制取酵母抽提物的最佳工艺条件,通过单因素试验获得外加酶法制取酵母抽提物的最佳工艺条件,并比较其与传统工艺条件的效果;使用GC MS对最终产物进行风味分析.通过优化得到最佳工艺条件为添加中性蛋白酶,外加酶0.20％,pH 6.0,酶促溶时间36 h,得到的该抽提物中含有多种酸类、酯类和醇类等物质.研究表明,外加中性蛋白酶法是开发利用啤酒废酵母制备酵母提取物的较好方法,得到的产物营养丰富.【总页数】5页(P159-162,219)【作者】吴满刚;雷姝敏;卞君杰;费立天;于海;葛庆丰;姜虹;周平凡【作者单位】扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127;常州市菜根香生态农业有限公司,江苏常州 213000【正文语种】中文【相关文献】1.生产啤酒酵母抽提物的工艺研究 [J], 莫重文;魏安池2.外加蛋白酶对酵母抽提物酶解效果的工艺研究 [J], 陈军;何洁3.外加酶促啤酒废酵母自溶制备酵母抽提物及理化性质检测 [J], 郭广超;江凌;田小群;陈江;梁世中4.用提取甘露聚糖后的废啤酒酵母残渣生产α-淀粉酶的研究 [J], 戴玲;王晓永;李全明;黄汝多5.啤酒酵母培养及影响其酶促合成ATP的因素 [J], 史肖云;邱蔚然;等因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
从废弃啤酒酵母细胞提取乙醇脱氢酶的新工艺
乙醇脱氢酶（ADH）是一种非常重要的酶，可以用于生物燃料。
目前，运用传统方法
制备乙醇脱氢酶，大多数技术门槛较高，收益较低。
本文提出了从废弃啤酒酵母菌细胞（S. cerevisiae）中提取乙醇脱氢酶的新工艺，以提高生物燃料的可持续性。
本研究以啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞为研究对象，从废弃啤酒酵母
细胞中提取乙醇脱氢酶。
首先，废弃啤酒酵母细胞以4℃的温度被调配到0.01M的；接着，采用激光诱导凝胶电泳的方法对乙醇脱氢酶的分子量和活性进行评估；最后，采用免疫印
迹实验以筛选高活性的乙醇脱氢酶菌株。
结果表明，在测试的乙醇脱氢酶中，S. cerevisiae能够提供高质量的乙醇脱氢酶。
它的活性较高，在体内具有较高的在乙醇水溶液中的酶转化率。
因此，提取乙醇脱氢酶可
能成为一种有效的生物燃料产业发展技术。
在本研究中提出的工艺，为生物燃料的研究和可持续利用开辟了新的前景。
与传统技
术相比，此工艺的成本更低，而且可以有效地利用废弃的细胞，减少废弃物的产生，更符
合环保要求。
总之，通过废弃啤酒酵母菌细胞提取乙醇脱氢酶，有助于提高资源利用效率，减少废
弃物产生，创造可持续的生物燃料。
但是，乙醇脱氢酶产量仍不能完全满足技术应用的需求，因此有必要进一步优化生产工艺，以更好地利用资源。
实验三酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究醇脱氢酶（ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。
生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。
醇脱氢酶来源广泛，种类繁多，可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶，所含肽链氨基酸残基数分别为250、375和600~750，酵母醇脱氢酶（YADH）是其中研究和应用最为广泛的一种。
酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶，可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。
酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含347个氨基酸残基，亚基相对分子质量为35 000。
（一）酵母醇脱氢酶的提纯一、实验目的1. 学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法；2. 掌握醇脱氢酶活力的测定方法。
二、实验原理以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。
在提纯过程中，每经一步提纯处理，都需测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力(本实验中比活力=活力单位数/mg蛋白质)。
唯有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了。
醇脱氢酶的辅酶NAD（以NAD为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢酶，动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢，酵母醇脱氢酶无此活力。
另有以NADP为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇。
），它能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD+还原。
CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+当有过量的醇存在时，NAD+ 被还原的速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多。
NADH对340nm紫外线有较强吸收，NAD+ 无此能力，因此可用测定A340nm 的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。
0本实验用Folin-酚试剂法测定蛋白质含量三、实验材料、仪器和试剂1．实验仪器：（1）干酵母粉：将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。
干燥后，研磨成粉末。
综合实训5 啤酒废酵母酶解制备抽提物的实训一、实训目的啤酒废酵母是啤酒生产的重要副产物，其量约占啤酒产量的0.15%。
长期以来，多数啤酒企业把啤酒生产中的大量废酵母排入污水管道，造成了严重的环境污染。
然而，这些大量废弃的啤酒酵母除含有50%左右的蛋白质、6%-8%的核酸外，还含有丰富的B族维生素、维生素D2,脂肪、多糖、矿物质以及多种经济价值很高的辅酶和生理活性物质，如辅酶A、辅酶Q、辅酶I、细胞色素C,凝血质、谷肌甘肤和麦角多醇等。
以啤酒废酵母为原料制备各种酵母抽提物，能为啤酒废酵母的综合利用带来很好的经济效益，是值得深入研究的课题。
啤酒酵母抽提物(又称酵母自溶液，酵母浸出物，酵母味素等)的制备方法主要有自溶法、酶解法、酸碱分解法、高压均质机法等。
本实验采用酶解法，进行了制备酵母抽提物的酶解试验，并测定酶解后的氨态氮的含量，分析酶解后的氨态氮与总氮的比值，从而了解酶解法制备酵母抽提物的效果。
通过实训培养学生的动手能力，并掌握酵母酶解的基本操作和氨态氮的测定技术。
1、实训前准备工作（1）仪器设备：超声波破碎仪，PH计，100ml锥形瓶4个；3ml微量滴定管；500mL容量瓶，恒温水浴锅，电子天平， 0-1000Ｃ温度计，250mL烧杯1个，高速离心机，100 mL量筒1个，50mL量筒1个，5mL移液管1支，具塞试管2支玻棒，标签纸，保鲜膜等。
（以上玻璃仪器为单组数量，需按6组准备）（2）材料试剂：①新鲜啤酒废酵母；②风味蛋白酶；③0.02mol/L、0.1mol/L标准氢氧化钠溶液；④中性甲醛溶液：在500ml 37％分析纯甲醛溶液中加入10ml 0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中；⑤酚酞指示剂：0.5 克酚酞溶于100 ml50 ％的乙醇溶液中。
2、实训步骤（1）用电子天平称取20克新鲜啤酒废酵母，置250mL烧杯中，加200mL水，充分搅拌约2分钟，配置成有一定浓度均匀的酵母悬浮液;（2）然后，用高速离心机对酵母悬浮液进行离心分离，5000rmp ，10分钟，倾倒上清液，再用200 mL水分三次把酵母泥完全洗脱到250mL烧杯中并搅拌均匀，并调节PH值至6.0，吸取25mL混合液，移入具塞试管内，贴标签样1（静置放冰箱，第2天取上清液进行滴定实验）;（3）把盛有175mL酵母液的250mL烧杯置超声波破碎仪中，进行超声波细胞破碎，设置200W功率，超声时间5s、间隙5s、总工作时间5min。
啤酒废酵母的综合利用研究进展苏海荣，王家林（青岛科技大学生物工程与技术系发酵工程实验室，山东青岛266042）摘要：啤酒废酵母是啤酒工业的副产物，它含有丰富的营养成分及生理活性物质，应用前景广阔，本文主要从啤酒酵母泥的营养成分、生理活性物质及其在污水处理方面的作用等方面介绍了啤酒废酵母的应用研究进展。
关键词：啤酒废酵母；生理活性物质；污水处理我国是啤酒生产大国，产量居世界之首，而啤酒废酵母是啤酒行业的主要副产物之一，充分合理利用酵母泥，变废为宝，不仅可获得一定的经济效益，而且还具有明显的环境效益和一定的社会效益。
啤酒酵母属于真菌，含有丰富的营养成分，据测定，它含有50%左右的蛋白质，6%～8%的RNA，细胞壁中含有25%～35%的酵母多糖，维生素和矿物质含量也十分丰富[1]。
同时，啤酒酵母还含有丰富的酶系和生理活性物质，如辅酶A、辅酶Q、辅酶I、细胞色素C、凝血质、谷胱甘肽等，应用前景广阔。
国外对啤酒酵母泥的综合利用研究比较深入，而国内研究则相对落后，没有将其充分利用。
随着科学技术的进步和生物技术的不断发展，啤酒酵母泥的利用与开发越来越受到人们的关注。
1.啤酒废酵母营养成分的应用研究啤酒废酵母含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪、粗纤维、矿物质等营养成分，蛋白质含量高达细胞干重的50%，含有人体和动物必需的8种氨基酸，在食品工业与饲料生产行业中应用广泛。
1.1食用营养酵母食用营养酵母是一种可食用的、营养丰富的单细胞微生物，是一种无酶活力、干燥的死酵母，既不需要提取，也不需要附加物。
将废啤酒泥回收，经过清洗、脱苦、干燥工艺即可得到低水分含量的干酵母粉末[2]。
目前直接食用营养酵母，以获取酵母的丰富、均衡的营养，发挥酵母的各种保健作用，正在欧美等发达国家和地区流行。
随着我国居民营养知识的普及和对酵母的认识，食用酵母的营养价值逐渐被接受。
食用酵母的主要营养成分包括：蛋白质及氨基酸、B族维生素、矿物质、多糖、麦角固醇、谷胱甘肽等。
№.6 陕西科技大学学报 Dec.2007 Vol.25 J OU RNAL OF SHAANXI UN IV ERSIT Y OF SCIENCE&TECHNOLO GY ・41・3 文章编号:100025811(2007)0620041204啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究毛跟年,张晓霞,张云丽,遆艳萍(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安 710021)摘 要:以废弃的啤酒酵母为原料,采用超声辅助的方法对其中的AD H进行了提取.实验考察了料液比、啤酒酵母用量、p H、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度对AD H提取效果的影响,进一步通过L9(33)正交试验对AD H的提取工艺进行了优化,得到了啤酒废酵母中AD H提取的最优方案为p H值8.5、超声功率320W、超声时间10min,在此条件下所得的AD H活力可达1806U/mL.关键词:啤酒废酵母;乙醇脱氢酶;提取中图分类号:Q554+.9 文献标识码:A0 引言乙醇脱氢酶(AD H)属氧化还原酶第一亚类,作用于-CHO H基团,是以NAD+、NADP+或PQQ为辅酶,催化伯醇和醛之间可逆反应的一种含锌金属酶,为胞内酶[124],已广泛应用于化工、医药、食品等工业领域.目前商品AD H多来源于动物肝脏,提取纯化工艺比较成熟,但其资源有限且价格昂贵,远远不能满足市场的需要,而啤酒厂废弃的啤酒酵母中含有大量的AD H.本文主要研究了从啤酒废酵母中提取AD H的工艺,为拓宽AD H的来源、降低AD H的生产成本提供了新的途径.1 材料与方法1.1 材料与设备(1)啤酒废酵母:由西安汉斯啤酒厂提供.(2)药品试剂:辅酶Ⅰ(NAD+)(Sigma公司生产),磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇等均为分析纯试剂.(3)仪器设备:H H22超声波细胞粉碎机(国华电器有限公司)、T G L216G台式离心机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、UV29100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)等.1.2 实验方法1.2.1 AD H活性测定AD H活性测定采用Vallec2Hoch法[5].将0.1mL AD H酶液与3mL p H为8.5的磷酸盐缓冲液混合,于37℃水浴预热5min,然后加入0.4mL的2M乙醇和0.1mL的4.5mM NAD+溶液,37℃水浴反应5min,立即置于沸水中灭活,于340nm波长处检测吸光度值.空白对照用蒸馏水代替加NAD+,其余均相同.AD H酶活力(U/mL)定义:将AD H在37℃每分钟氧化乙醇脱氢生成乙醛,即还原NAD+为NAD H,在340nm处测定的吸光度变化0.001作为一个活力单位(U).1.2.2 AD H的提取方法3收稿日期:2007-09-17作者简介:毛跟年(1962-),男,陕西省泾阳县人,教授,研究方向:生物制药陕西科技大学学报第25卷啤酒废酵母经反复冻融后离心浓缩,与一定体积的磷酸盐缓冲液混合,再在低于4℃的条件下采用超声波辅助的方法进行细胞破碎,每超声1s 间歇3s ,10000r/min 离心15min ,上清液在340nm 波长处测定吸光度值,计算AD H 活力.1.2.3 AD H 提取工艺的单因素实验在AD H 提取实验中,固定其他条件,以提取液中AD H 活力为指标,分别对料液比、样品处理量、提取液p H 、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度进行考察,以确定各影响因素的适宜水平.1.2.4 AD H 提取工艺的正交试验在单因素实验的基础上,选择对AD H 提取效果影响较大的因素,以提取液中AD H 活力为指标,按照正交试验原理进行正交设计,每个水平设3个重复,对正交试验结果进行直观分析和极差分析,以确定啤酒废酵母中AD H 提取的最优方案.2 结果与讨论2.1 不同因素对啤酒废酵母中AD H 提取效果的影响2.1.1 料液比的确定表1 样品处理量对AD H 提取效果的影响啤酒废酵母/g磷酸盐缓冲液/mL AD H 活力/(U/mL )10202040350466在细胞超声破碎工艺中,提取液用量一般为样品处理量的3～5倍.但本实验通过对不同料液比下所得的AD H 活力进行比较,最终确定以啤酒废酵母量(w )∶提取液(v )为1∶2较为适宜.主要是由于实验所用材料为啤酒厂废弃的啤酒酵母,成分比较复杂,酵母菌体数量相对较少.选用较高的料液比例有利于提高单位提取液中AD H 的含量.2.1.2 样品处理量对AD H 提取效果的影响分别取10g 和20g 啤酒废酵母,按照1∶2的比例用p H 为8.5的0.01mol/L 磷酸盐缓冲液对AD H 进行超声辅助提取,超声波功率250W ,超声全程时间10min.提取液中ADH 活力的测定结果见表1.由表1可以看出,采用10g 和20g 啤酒废酵母在相同条件下进行超声辅助提取时,AD H 活力分别为350U/mL 和466U/mL ,后者不仅提取出的AD H 活性高,而且一次可以获得较多的粗酶液,故后续实验中均采用20g 的样品处理量.图1 p H 对AD H 提取效果的影响 图2 超声波功率对AD H 提取效果的影响2.1.3 p H 值对AD H 提取效果的影响取20g 啤酒废酵母,用不同p H 的磷酸盐缓冲液对AD H 进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活性测定结果如图1所示.由实验结果可知,啤酒废酵母中AD H 提取的适宜缓冲液p H 范围为8.5～9.5,在此范围内AD H 活性最高,升高或降低缓冲液的p H 值均可导致AD H 活力降低.2.1.4 超声波功率对AD H 提取效果的影响将20g 啤酒废酵母用p H 为8.5的磷酸盐缓冲液在不同功率的超声波下进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活性测定结果如图2所示.由实验结果可知,适宜于啤酒废酵母中AD H 提取的超声功率在320W 左右.超声波功率不同,AD H 的提取结果差异较大.AD H 为胞内酶,较低的超声波功率无法・24・第6期毛跟年等:啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究实现啤酒酵母细胞的充分破碎,AD H 不能完全释放出来.但若超声波功率太大,则产生的高温会对AD H 的活性造成影响,故在后续的AD H 提取工艺中超声波功率选定为320W.图3 超声全程时间对AD H 提取效果的影响 图4 提取液浓度对AD H 提取效果的影响2.1.5 超声全程时间对AD H 提取效果的影响将20g 啤酒废酵母采用功率为320W 的超声波按不同处理时间进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活力的测定结果如图3所示.由实验结果可知,超声处理全程时间不同时AD H 的提取结果也有所不同,处理时间过短不利于酵母细胞完全破碎,处理时间过长则会产热升温而使AD H 活性降低,比较适宜的超声全程时间在10min 左右.故在后续的AD H 提取工艺中,采用功率为320W 的超声波在全程时间10min 下进行实验.2.1.6 提取液浓度对AD H 提取效果的影响选用不同浓度的缓冲液,在功率为320W 的超声波下全程处理10min 对20g 啤酒废酵母进行提取,其他条件同2.1.2,AD H 活性测定结果如图4所示.由实验结果可知,在所选的提取液浓度范围内,AD H 的提取效果随着提取液浓度的增加而升高,但最终确定提取液浓度以0.08mol/L 较为适宜.考虑到温度较高时AD H 活力下降较快,故整个提取过程是在冰浴状态下进行的,以维持提取液温度在4℃以下.由于0.08mol/L 磷酸盐缓冲液在4℃以下时已接近饱和,因此继续提高提取液浓度对提取AD H 意义不大.表2 L 9(33)正交试验结果序号A (p H 值)B (超声波功率)/W C (超声全程时间)/minAD H 活力/(U/mL )18.5(1)280(1)10(1)161228.5(1)320(2)15(2)163838.5(1)360(3)20(3)177849.0(2)280(1)15(2)151859.0(2)320(2)20(3)165469.0(2)360(3)10(1)162279.5(3)280(1)20(3)17489.5(3)320(2)10(1)118899.5(3)360(3)15(2)474Ⅰ502832844422Ⅱ483445203630T =Ⅰ+Ⅱ+ⅢⅢ181638743626R321212367962.2 啤酒废酵母中AD H 提取工艺条件的优化根据单因素实验结果,以提取液p H 、超声波功率和超声全程时间为影响因素,提取液中AD H 活力为考察指标,设计了L 9(33)正交试验,实验结果见表2.2.2.1 极差分析由正交试验表极差分析所得的极差值R 的大小可以看出,3个因素对AD H 提取效果的影响大小依次为A >B >C ,即提取液p H >超声波功率>超声全程时间.比较正交表中各列的位级值大小可以得出AD H 提取的最优方案为A 1B 2C 1,即提取液p H 为8.5、超声波功率为320W 、超声全程时间为10min.但此方案并未出现在上述正交表中,故需对其进行验证性实验.2.2.2 方案验证取20g 啤酒废酵母,加入p H 为8.5的0.08mol/L 磷酸盐缓冲液40mL ,超声波功率为320W ,每超声1s 间歇3s ,超声全程时间10min ,操作温度控制在4℃以下.经3次重复实验,测得提取液中AD H 活力平均值为1806U/mL ,高于正交表中的最高值1778U/mL ,可见极差分析得到的提取方案可以作为啤酒废酵母中AD H 提取的最优方案.・34・陕西科技大学学报第25卷3 结论(1)运用超声辅助的方法对啤酒废酵母中的AD H 进行提取,得到的最优工艺条件为:20g 啤酒废酵母中加入p H 为8.5的0.08mol/L 磷酸盐缓冲液40mL ,采用的超声波功率为320W ,每超声1s 间歇3s ,超声全程时间为10min ,操作温度控制在4℃以下.在此条件下,获得的提取液中AD H 活性最高,可以达到1806U/mL.(2)研究表明,AD H 在温度较高时活力容易损失,故AD H 提取过程宜在低温下进行.将细胞冻融破碎法与超声辅助提取工艺相结合用于啤酒废酵母中AD H 的提取,既可减少高温对AD H 活性的影响,又能促进啤酒酵母细胞破碎,提高AD H 的提取效果.(3)目前,国内外市场中的AD H 多来源于动物肝脏,资源有限,价格昂贵.由于本研究从废弃的啤酒酵母中提取AD H ,既可省略复杂的微生物发酵过程,大大减少人力、物力和财力投入,降低生产成本,又能充分利用工业废弃物,减少工业废弃物所造成的环境污染,因此是拓宽AD H 来源的一条好途径.参考文献[1]Suck 2Y oung Y oon ,Hyang 2soon Noh ,Eun 2Ho K im ,et al .The highly stable alcohol dehydrogenase of T hermomicrobi um roseum :pur 2ification and molecular characterization[J ].Comparative Biochemistry and Physiology Part B ,2002,132:4152422.[2]J ulija Razumiene ,Vidut Gureviciene ,Aist Vilkanauskyt.Improvement of screen 2printed carbon electrodes by modification wit h ferro 2cene derivative[J ].Sensors and Actuators B ,2003,95:3782383.[3]Helmut Grisch.The et hanol oxidation system and it s 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1806U/mL.K ey w ords :abandoned beer yeast ;alcohol dehydrogenase (AD H );ext raction・44・。
