磷酸酶的测定方法

酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶是一种酶类物质，它在人体细胞内起着重要的催化作用，并具有重要的调节作用。

因此，在许多疾病的诊断中，检测酸性磷酸酶的活性和浓度是非常重要的。

以下是关于酸性磷酸酶的显示方法的中文介绍。

常见的酸性磷酸酶显示方法包括酶活力测定、基础染色和免疫染色等。

这些方法可以通过不同的化学试剂和仪器设备来实现，从而得出酸性磷酸酶的活性和浓度。

2. 酶活力测定法
酶活力测定法是用于检测酸性磷酸酶活性的一种方法，其原理是通过一系列的化学反应来形成可测定的产物。

这种方法通常使用p-nitrophenyl phosphate（pNPP）作为酶活力测量底物，它可以转化为p-nitrophenol。

测量产生的p-nitrophenol的光密度可以用于计算样品中酸性磷酸酶的活性。

3. 基础染色法
基础染色法是通过将酸性磷酸酶活性产生的颜色染到细胞和组织切片上来显示酸性磷酸酶的分布和浓度。

这种方法使用基础染料如甲基绿、苏木精、尤红和新绿等来染色，然后通过显微镜观察染色后的细胞和组织切片来判断样品中是否含有酸性磷酸酶。

免疫染色法是通过使用抗体来检测酸性磷酸酶的存在和浓度的方法。

该方法使用细胞和组织切片，将其与具有特异性抗体的二抗结合，然后用荧光素或酶标记的标记剂来标记结合的二抗。

最终，通过荧光显微镜或酶标的方法来检测抗体与酸性磷酸酶的结合情况。

总结：。

土壤酸性磷酸酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定⑴原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。

⑵测定方法①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.2 mL甲苯和4 mL ph6.5 磷酸缓冲液，再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，摇匀；③而后在2500r/min下离心5min；取上层清夜于10ml 离心管4000r/min下再离心5min.④取上清液在410 nm处比色，并记录吸收光值。

⑶标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。

表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、120.005?mol/mLpNP（mL）0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 0.09 0.10 0.11 0.12H2O（mL）0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.72 0.71 0.70 0.69 0.68pNP的含量（?mol）0、0.00005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006摇匀0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液（mL） 40.5mol/L CaCl2（mL） 10.5mol/L NaOH（mL） 4②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。

土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。

在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。

积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。

研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。

磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。

测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。

后一种称为无机磷含量法。

研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。

所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。

测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。

常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。

3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。

4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。

碱性磷酸酶测定一、试剂配制1、甲苯2、pH9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：称取20g纯氯化铵，溶于少量水（我配200ml，用一百多毫升水溶40g氯化铵），然后加入浓氨水润洗烧杯和定容至100ml，用pH试纸测pH，pH为10即可，不用刻意调pH。

（氨水很臭，需要带口罩在通风橱配）3、8%铁氰化钾溶液（只能用一周，放冰箱保存）：取8g铁氰化钾，用水定容至100ml。

4、2%4-氨基安替比林（只能用一周，放冰箱保存）：取2g4-氨基安替比林，用水定容至100ml。

5、0.5%磷酸苯二钠溶液（用pH9.4硼酸缓冲液配）（1）先配制pH9.4硼酸盐缓冲液：称取4.768g硼砂（十水合四硼酸钠）和0.44g纯氢氧化钠，用蒸馏水定容至1000ml。

（硼砂需要用电炉加热配制，硼砂用称量纸称量，氢氧化钠需要用烧杯称量,基本不用配pH，pH试纸测为9）（2）称取5.05g磷酸苯二钠，用pH9.4硼酸缓冲液定容至1000ml。

6、酚标准溶液：酚溶液：称取1g苯酚用水溶至1L，保存于暗色瓶中。

（苯酚还是需要水浴加热，详细配法看脲酶测定，但由于1g很难准确称量，并在我配完发现天平托盘上结了一层苯酚，但测量后不影响标线的准确程度，R值为三个9）酚工作液：取10ml原液用水稀释至1L(1ml中含0.01mg/mL)二、测定过程1、称取5g过1mm筛的土样于绿色塑料瓶（每个样需要3个重复，前两个重复和第三个重复分开放，第三个重复为无基质重复，每天做两个无土样重复，此重复加甲苯、磷酸苯二钠溶液），加5滴甲苯（用滴管加5滴），盖盖盖子后用震荡机低速震荡15min（我选择160的速度），然后给第三个重复加入20ml蒸馏水，给前两个重复加入20ml磷酸苯二钠，盖上盖子后充分摇匀后在37摄氏度恒温箱培养2小时。

2、培养结束后过滤，过滤后取5ml滤液加入50ml容量瓶（用5ml枪加，由于过滤液体没那么多，每加一个样用两遍蒸馏水润洗枪），加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢氧化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾溶液（用1ml枪加），每加一种都要充分摇匀。

磷酸单酯酶（对硝基苯磷酸盐法）(Tabatabai, 1994)1.原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。

酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。

2.试剂: （1）甲苯。

（2）pH 6.5缓冲溶液：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol ﹒L－1）溶液调至pH6.5，用水定容；或pH 11缓冲溶液：用氢氧化钠（0.1 mol﹒L －1）溶液调至pH11，用水定容。

通用缓冲液：称取12.1g三（羟甲基）氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3g硼酸于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用。

)（4）对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。

（5）0.5 M CaCl2溶液：称取73.5 g CaCl2﹒2H2O溶解于700 mL水中，用水定容到1L。

（6）0.5 mol﹒L－1 NaOH溶液：称取20 g NaOH 溶解于700 mL水中，用水定容到1L。

（7）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0 g 对硝基苯酚于700 ml 水中，稀释至1L，低温保存。

配置工作曲线用的溶液。

将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml三角瓶中（分别含0 mg、0.01 mg、0.02 mg、0.03 mg、0.04 mg、0.05 mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5 ml，再加入1 ml的CaCl2和4 ml 的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400 nm－420 nm条件下比色。

3. 仪器:50mL三角瓶；培养箱；分光光度计4. 步骤:将1.00 g新鲜土样（< 2 mm）放入50mL三角瓶中，加入0.2 mL 甲苯、4 ml的缓冲液和1 ml的对硝基苯磷酸二钠溶液。

磷酸酶活性测定磷酸酶可催化磷酸脂类或磷酸酐的水解,其活性的高低直接影响着土壤有机磷的分解转化及其生物有效性(耿玉清等，2008)。

土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，可作为反映土壤磷素水平的一项生物指标（于群英，2001）。

测定方法: 磷酸苯二钠比色法1. 试剂配制（1） pH9.8氯化铵―氢氧化铵缓冲液100mL：取20g纯氯化铵，溶于100mL浓氢氧化铵中。

（2） 8%铁氰化钾液100mL:取8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中，稀释至100mL(此液只能用一周)。

（3） 2% 4-氨基氨替比林液100mL:取2g 4-氨基氨替比林溶于水中，稀释至100mL(此液只能用一周)。

（4） 0.5%磷酸苯二钠溶液500mL:取2.5g磷酸苯二钠溶于水中，稀释至500mL。

（5）酚的标准溶液：酚原液：取1g重蒸酚（phenol,又名石碳酸）溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。

酚工作液：取10mL酚原液稀释至1L（每mL含0.01mg酚）。

（6）甲苯。

2. 操作步骤（1）标准曲线绘制：取1，3，5，7，9，11，13mL酚工作液置于50mL容量瓶中，另取一管做空白对照，分别加入20mL蒸馏水。

再加入0.25mL缓冲液、0.5mL 4-氨基氨替比林液，0.5mL铁氰化钾液。

每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50mL。

在15min内，在分光光度计上于510nm处比色测定溶液的光密度。

最后绘成标准曲线。

（2）土壤磷酸酶活性测定：称5.00g风干土样，置于50mL三角瓶中，加5滴甲苯后再加入20mL0.5%磷酸苯二钠,充分振荡后于37℃恒温箱中培养2h。

取培养后的滤液5mL，按标准曲线所述方法显色，比色测定。

土壤样品酶活性测定分三次进行：新鲜土样测量一次，风干后测量一次，风干土样保存1个月后再测量一次。

3. 结果计算磷酸酶活性，以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示。

磷酸酶活性测定1.试剂配制(1)PH=9.8氯化铵－氢氧化钠缓冲液取20g NaOH溶于100mlNH4OH中(2)8%铁氰化钾液称8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中稀释至100ml（仅在同一周内存放）(3) 2% 4－氨基安替比林液取1g 4－氨基安替比林溶于水中，稀释至50ml（仅在同一周内存放）(4)0.5%磷酸苯二钠溶液取1g溶于200ml水中(5) 酚的标准溶液（不要配）酚原溶液的配制及酚工作液的稀释浓度同磷酸苯二钠法酚原液：取1g溶于水中，稀释至1L存于棕色瓶中酚工作液：取10ml酚原液稀释至1L（0.01mg/ml酚）(6) 甲苯标准曲线绘制吸取1,3,5,7,9,11,13ml酚工作液，分置50ml的容量瓶中，分别加20ml蒸馏水，再加0.25ml 缓冲液，0.5ml4－氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。

最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。

根据光密度值于溶液浓度绘制标准曲线。

50－（20＋2＋0.5＋0.5＋0.25）=26.75ml蒸馏水2.操作步骤取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加5滴甲苯。

20ml 0.5%磷酸苯二钠，充分振荡后在37℃恒温箱中培养2h。

取培养后滤液5ml，分置50ml的锥形瓶中，加20ml蒸馏水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml 4－氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。

最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。

3．计算磷酸酶的活性（M），以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示 M＝x×80×0.32×2.29标准曲线：y=0.002161x-0.000839即：M=（y+0.000839）×80×0.32×2.29/0.002161 式中：x：从标准曲线查得5ml滤液中酚的完整数 y：510nm处吸光度80：换算为100g土壤的余数0.32：在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚相当于0.32g重量单位的磷 2.29：将P换算为P2O5的系数。

酶活性测定方法磷酸酶是一类涉及重要生命过程的酶，研究它们在许多生理病理过程中的功能及其调控机制对了解细胞代谢，发育和信号转导的重要意义。

磷酸酶的活性可以通过测定其反应中形成的产物的数量来评价。

该测定可以为研究它们在特定环境中的活性变化提供重要的信息，因此，磷酸酶活性测定方法对于生物学研究显得尤为重要。

磷酸酶活性测定可以采用多种方法完成，其中，最常用的色谱法、光度法、EC法等。

一、色谱法色谱法是一种测定磷酸酶活性的常用方法，它采用磷酸酶催化把被测物质（典型的指磷酸核苷等）水解后形成可见的特异物质，其吸光度可以被检测和测定。

实施此方法的具体流程是：（1）振荡：将磷酸酶、被测样本、受体者和调节剂等组分，按照一定比例配制在离心管中，在一定温度下振荡混匀；（2）定量：经过一定时间的反应，取样经过色谱检测，测定经磷酸酶催化水解后形成的特异物质的吸光度，以计算出磷酸酶活性；（3）统计处理：比较样本和标准曲线，对测定磷酸酶活性做出统计处理，得出最终结果。

二、光度法光度法是直接测定磷酸酶反应中受体者的吸光度来计算磷酸酶活性的方法，其具体原理是：当受体者发生磷酸酶催化水解反应时，会形成有明显吸光度的特定产物，其吸光度及得数可以用来计算磷酸酶活性。

三、EC法EC法是用电导率检测磷酸酶引起受体物质离子化的方法，它是一种快速精确、方便有效的测量磷酸酶活性的方法；其原理是：当受体物质在磷酸酶的作用下水解发生时，电导率会发生显著增加，根据其程度及电导率值变化程度，可以直接由测试数据计算磷酸酶的活性。

以上就是磷酸酶活性测定的三种常用分析方法，它们各自具有自身的优缺点，实验者可以根据自身需求选择适合的分析方法，从而更直观的分析和了解磷酸酶活性的变化情况。