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灰树花子实体多糖的微波提取及絮凝纯化工艺满宁;孙盼;韩伟【摘要】以得率为指标,去离子水为溶剂,微波提取灰树花多糖,得到最佳提取工艺为:药材粒径840～2 000 μm,液固比30 mL/g,微波提取210 s,溶剂pH=6;以脱蛋白率和多糖保留率为指标,壳聚糖为絮凝剂纯化灰树花多糖提取液,得到最佳工艺参数为:壳聚糖1.0 mL/g,絮凝1h,液药比40 mL/g,药液pH=6,温度控制在45℃.与其他工艺相比,本文采用的微波提取及絮凝纯化方法操作高效,能有效提高灰树花多糖的得率和纯度.【期刊名称】《南京工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(037)006【总页数】6页(P99-104)【关键词】灰树花;多糖;微波;絮凝【作者】满宁;孙盼;韩伟【作者单位】华东理工大学药学院中药现代化工程中心,上海 200237;华东理工大学药学院中药现代化工程中心,上海 200237;华东理工大学药学院中药现代化工程中心,上海 200237【正文语种】中文【中图分类】R284.2灰树花（Grifola frondosa）是一种药食两用非褶菌目、多孔菌属大型真菌，又名千佛菌、贝叶多孔菌、栗子蘑等，属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲［1－3］。
灰树花的主要生物活性物质灰树花多糖含丰富的β-1，6-糖苷键及β-1，3-糖苷键［4］，具有抗艾滋（HIV）病毒，抗肿瘤，降血压，调节血糖、血脂及胆固醇水平，增强免疫系统功能的作用［5］，对艾滋病、高血压、糖尿病等疾病防治及免疫系统功能下降具有一定的疗效，且无毒副作用［6－9］。
传统的多糖提取方法有热水提取法、酸提法和碱提法等［10］。
一般的脱蛋白纯化方法为醇沉法、Sevage法和三氯乙酸法等［11］。
这些提取和纯化方法存在操作时间长、试剂用量大、效率低、效果差等缺点。
微波萃取是一项新型提取技术，具有节省时间，提高提取效率，降低耗能，提升产率等优点［12］。
絮凝纯化法能有效除去中药材中酚类物质、蛋白质、色素等杂质，不破坏有效成分，具有絮凝剂用量少、无残留、高效等特点。
测定多糖含量测定方法
多糖含量的测定方法有多种，以下列举几种常用的方法：
1. 酚-硫酸法：将待测样品加入酚-硫酸混合液中，经强酸催化后，产生深棕色或褐色色素，根据其吸收波长测定其光密度，即可得到多糖含量。
2. 比色法：将待测样品加入反应液中，经过酸或碱催化后，与磷钨酸等试剂发生比色反应，测定吸收波长，计算多糖含量。
3. 全甘蔗多糖含量测定法：利用全甘蔗多糖的特性，在酸性条件下能与硫酸基团结合产生黄色化合物，根据其吸收波长测定光密度，计算多糖含量。
4. 中性多糖含量测定法：利用中性多糖的特性，在加酸或碱后，能够水解为单糖，利用安替比林反应或酶法，测定水解产物里的糖含量，根据比例关系计算多糖含量。
5. 光学活性低分子糖含量测定法：利用光学活性低分子糖所具有的旋光性质，通过测定样品的旋光度，计算出其中低分子糖的含量，进而计算多糖含量。
灰树花糖蛋白中总糖含量的测定
灰树花糖蛋白中总糖含量的测定
探讨糖蛋白中总糖含量测定的简捷方法,以2种灰树花糖蛋白(GF6A,GF6B)为原料,分别以硫酸-苯酚法和次亚碘酸钠法对其中的总糖含量进行了比较分析.结果显示,应用前者方法测定多糖含量分别为85.45%和38.46%,采用后者方法测定结果分别为87.03%,36.51%, 2种方法测定的结果相近,其中以硫酸-苯酚法因不需对样品进行预水解,方法简便、可靠,更适合于糖蛋白中总糖含量测定.
作者：杨晓华于广利赵峡宋乐天高昊东 YANG Xiao-Hua YU Guang-Li ZHAO Xia SONG Le-Tian GAO Hao-Dong 作者单位：中国海洋大学海洋药物与食品研究所,山东,青岛,266003 刊名：中国海洋大学学报（自然科学版）ISTIC PKU英文刊名：PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA 年，卷(期)：2006 36(6) 分类号：Q936 关键词：灰树花糖蛋白硫酸-苯酚次亚碘酸钠总糖。
多糖含量测定的几种不同方法比较系别:信息学院专业:生物工程学号:姓名:指导教师:指导教师职称: 讲师多糖含量测定的几种不同方法比较摘要：本文综述了多糖含量测定的几种常用方法，主要有苯酚-硫酸法、3, 5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)、蒽酮-硫酸法、色谱法、红外光谱定量分析多糖法等。
并对这些方法的优缺点进行了分析和比较。
这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考，并为多糖含量测定的更深入研究提供一定的理论基础。
关键词：多糖；含量；测定；方法A review of different methodsto the determination of polysaccharidesAbstract: Paper reviewed some different methods to the determination of polysaccharides, in it phenol-vitriol method, 3, 5-two nitro salicylic acid (DNS) method, anthrone-vitriol method, chromatography, infrared spectrum quantitative analysis and etc had been dealed with. And the advantages and disadvantages of these methods are analyzed and compared. It provided some related information and based theories to the determination of polysaccharides content.Key words：polysaccharides; content; determination; methods目录中文摘要 (I)英文摘要 (II)1前言 (1)2化学法测定多糖含量 (1)2.1苯酚-硫酸法 (1)2.2 3, 5-二硝基水杨酸法(简称DNS法) (2)2.3蒽酮-硫酸法 (2)3色谱法测定多糖含量的研究 (3)3.1气相色谱法(GC) (3)3.2 液相色谱法(HPLC) (3)3.3薄层色谱法(TLC) (4)4其他方法 (4)4.1红外光谱定量分析多糖法 (4)4.2生物传感器法 (5)5结论 (5)6展望 (6)参考文献 (6)致谢 (9)1前言多糖(polysaccharides，PS)是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子[1]。
不同产地灰树花多糖含量测定
隆毅;李万芳;石俊英
【期刊名称】《食品与药品》
【年(卷),期】2012(000)009
【摘要】目的测定不同产地灰树花多糖含量，为灰树花多糖的综合开发利用提供科学依据.方法采用蒽酮-硫酸法，正交试验确定最佳工艺，测定不同产地灰树花粗多糖、可溶性糖含量.结果18批不同产地灰树花粗多糖含量8.17%~34.82%，可溶性糖含量27.46%~55.65%.结论不同产地灰树花多糖含量具有显著差异.
【总页数】3页(P331-333)
【作者】隆毅;李万芳;石俊英
【作者单位】山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东中医药大学药学院,山东济南250355
【正文语种】中文
【中图分类】Q539
【相关文献】
1.不同部位、不同产地及不同采集时间连翘中连翘酯苷A的含量测定 [J], 靖会;李教社;杨银京
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5.不同种不同药用部位不同产地千斤拔中总黄酮的含量测定 [J], 任朝琴;刘圆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
灰树花胞外多糖（GFP）的降血糖活性检测摘要】灰树花胞外多糖具有较好的降低血糖、改善糖耐量的功能，并且具有无毒副作用、不易反弹的良好效果。
【关键词】灰树花胞外多糖降低血糖本文较为系统地研究了灰树花胞外多糖的降低血糖、改善糖耐量以及对机体脏器的保护作用，为进一步探讨其降血糖活性机理提供理论依据。
1 仪器与材料灰树花胞外多糖由本实验室自制。
昆明种小白鼠：中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。
试验中用到的试剂均为分析纯，药品购自Sigma试剂公司。
2 方法2.1 模型小鼠的建立小鼠禁食16h后以200mg/kg.w腹腔注射2%四氧嘧啶，1h 后恢复饮食。
72h后再禁食2h断尾采血，血糖浓度大于11.1mmol/L即造模成功。
2.2 动物分组和处理Ⅰ期：60只小鼠分为正常组、模型组、阳性组（拜糖平）、GFP 低剂量组（30mg/kg.w）、中剂量组（100mg/kg.w）、高剂量组（300mg/kg.w）。
正常组和模型组每天灌胃等体积生理盐水，阳性对照组以300mg/kg.w灌胃拜糖平。
Ⅱ期试验：40只小鼠分为正常组、模型组、多糖组、阳性对照组。
当给药小鼠的血糖降低至正常范围后，再以最佳剂量的一半灌胃7天，照此连续三次减量灌胃后开始停药，停药两周后测定小鼠血糖。
2.3 测定指标及测定方法测定指标：血糖、糖耐量。
糖耐量曲线下面积= 0.5×空腹血糖值+ 30min血糖值+1.5×60min血糖值+120min血糖值。
血糖的测定：采用葡萄糖氧化酶法。
2.4 胸腺指数、脾指数及肾脏指数的测定计算方法：脏器指数=器官重量（mg）/体重（g）。
2.5 数据统计学处理先对数据进行方差齐整性检验，然后用SPSS统计分析软件对各组数据及数据间差异显著水平进行统计学分析，数据以 ±sd表示。
3 结果3.1Ⅰ期实验结果3.1.1 小鼠血糖变化实验开始时，正常组、模型组和三个给药组血糖无显著性差异(P >0.05)；造模后3d，腹腔注射四氧嘧啶使模型组小鼠血糖值急速升高，与正常组比较有极显著性差异(P <0.01)，造模成功。
顾华杰,黄金汇,金 琎,等.4种灰树花多糖测定方法的比较[J].江苏农业科学,2011,39(4):400-402.4种灰树花多糖测定方法的比较顾华杰1,黄金汇1,金 琎1,胡翠英1,王桃云1,陈家长2(1.苏州科技学院化学与生物工程学院,江苏苏州215009; 2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,江苏无锡214081)摘要:采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、费林滴定法等4种方法测定了液体发酵法培养的灰树花菌丝体的胞内多糖和胞外多糖,测定了每种方法的最佳吸收波长、标准曲线,比较了仪器精密度、重现性、稳定性及加样回收率。
结果表明:苯酚-硫酸法测定胞内多糖较好,最佳吸收波长为485nm;3,5-二硝基水杨酸法测定胞外多糖较好,最佳吸收波长为490n m。
关键词:灰树花;多糖;苯酚-硫酸法;蒽酮-硫酸法;3,5-二硝基水杨酸法;费林滴定法中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2011)04-0400-03(上接第399页)3 结论料液比、超声波辅助提取时间、提取温度均会影响马齿苋粗多糖提取量,其中提取温度影响最大,其次是固液比,提取时间的影响最小。
通过单因素试验和L9(33)正交试验得出马齿苋粗多糖的最佳提取工艺条件为:固液比1g 30mL,温度70 ,浸提时间30m in。
在最佳工艺条件下,开花期野生马齿苋草粉中粗多糖提取量为(10.1919 0.0403)%(风干基础)。
开花期野生马齿苋草粉中粗多糖相对常规饲料而言其含量较高,预计将马齿苋草粉添加到动物饲料中可以起到类似中草药饲料添加剂的某些功能,在提高动物免疫力方面能起到一定作用,但是作用程度还需通过动物试验进行深入研究和验证。
参考文献:[1]孔 娟,刘晓宇,王蕊霞,等.葛根多糖和黄酮综合提取工艺优化[J].食品科学,2010,31(6):43-47.[2]朱建飞,吴谋成,冯 睿,等.菜籽粕中水溶性多糖提取工艺优化[J].农业工程学报,2006,22(12):251-254.[3]肖美添,杨军玲,林海英,等.紫菜多糖的提取及抗流感病毒活性研究[J].福州大学学报:自然科学版,2003,31(5):631-635. [4]王亚飞,毕红梅.超声波法提取香菇多糖的研究[J].内蒙古科技与经济,2004(14):124-125.[5]王 莉,刘志勇,鲁建江,等.微波技术辅助测定马齿苋中总黄酮和多糖的含量[J].食品工业科技,2002,23(5):70,73.[6]田光辉,刘存芳,赖普辉.马齿苋多糖的超声提取及活性试验研究[J].食品研究与开发,2007,28(2):7-10.灰树花(Grifola frondosa)是多孔菌属的一种大型真菌,别称贝叶多孔菌、栗子蘑、佛菌、重菇等[1]。
经过大量的化学和药理分析发现,灰树花多糖具有明显的抗肿瘤,抗H I V病毒,改善免疫系统,调节血糖、血脂及胆固醇水平,降血压等作用,可防止癌细胞的生成和转移,对艾滋病、高血压、肥胖症、糖尿病以及免疫系统功能的紊乱都有一定的疗效,且无任何毒副作用[2]。
灰树花多糖是富含 -1,6-糖苷键及 -1,3-糖苷键的真菌多糖,生理活性显著[3]。
因此,对灰树花及其提取物中多糖含量的测定就显得十分重要。
测定多糖的方法很多,但不同方法适用的范围不同,对不同来源多糖测定的准确性、稳定性、重现性也不同。
本研究采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、费林滴定法等4种方法测定了液体发酵法培养的灰树花菌丝体的胞内多糖和胞外多糖,并对这4种测定方法进行了比较,为准确测定灰树花多糖提供依据。
1 材料与方法1.1 试验材料收稿日期:2010-09-01基金项目:现代农业产业技术体系建设专项(编号:nycyt x-48)。
作者简介:顾华杰(1981 ),男,江苏苏州人,硕士,实验师,主要从事食用菌生理生化研究。
E-m ai:l li ongu@m ai.l us 。
灰树花菌种购自江苏省高邮市食用菌研究所。
PDA液体培养基:马铃薯20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.3%,硫酸镁0.15%,维生素B10.001%,p H值自然。
1.2 试验方法1.2.1 液体培养条件 500mL锥形瓶,200mL液体培养基,恒温振荡培养箱27 160r/m in培养7d。
1.2.2 多糖提取 胞内多糖测定采用微波辅助热水浸提法[4-5]:将培养好的菌液经4层纱布过滤后得菌丝体,蒸馏水冲洗干净后,置于干燥箱中70 烘干至恒重,取干菌丝体粉末2g,按1g 40mL料液比加入蒸馏水,置于微波炉中,中高火(750W)加热10m i n,放入沸水浴中30m in,1000r/m i n 离心取上清液即为胞内多糖水溶液。
胞外多糖测定采用醇沉法[5]:取纱布过滤后的液体培养基加入4倍体积的95%乙醇,混匀后4 下放置24h,4 4000r/m i n离心20m in,沉淀中加入80mL蒸馏水,沸水浴溶解30m in,1000r/m i n离心取上清液即为胞外多糖水溶液。
还原糖测定采用酸水解法[6]:取制得的胞内多糖或胞外多糖水溶液15mL,加入6m ol/L盐酸10mL,搅拌均匀后在沸水浴中水解30m i n,冷却至室温后用6mol/L Na OH中和至中性,蒸馏水定容至100mL,即得胞内或胞外的还原糖水溶液。
1.2.3 多糖提取1.2.3.1 苯酚-硫酸法[7-8] 最大吸收波长的选择:吸取400江苏农业科学 2011年第39卷第4期0.1m g/mL葡萄糖标准品溶液0.6mL,加蒸馏水至1mL,在冰水浴中加入5%苯酚水溶液0.5mL、浓硫酸5mL,混匀,沸水浴2m i n,冷水浴冷却;以相应溶液作为空白对照,于400~ 600n m波长范围内扫描。
标准曲线制作:分别吸取0.1m g/mL葡萄糖标准品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL各3份,按最大吸收波长项下方法测定,以浓度(C)为横坐标,吸光度(D)为纵坐标,绘制标准曲线。
精密度试验:精确吸取葡萄糖标准品溶液0.4mL,按最大吸收波长项下方法测定5次D值。
重现性试验:分别取1mL的胞内多糖水溶液(稀释100倍)和胞外多糖水溶液(稀释10倍)各5份,按最大吸收波长项下方法测定D值。
稳定性试验:分别取1mL的胞内多糖水溶液(稀释100倍)和胞外多糖水溶液(稀释10倍)各1份,按最大吸收波长项下方法显色后,分别在10m i n、30m in、1h、1.5h、2h时测定D值。
加样回收率试验:取胞内多糖水溶液(稀释100倍)和胞外多糖水溶液(稀释10倍)各10mL,分别加入1mL葡萄糖标准品溶液后,各取5份1mL样液,按最大吸收波长项下方法测定D值,计算加样回收率。
1.2.3.2 蒽酮-硫酸法[7,9] 最大吸收波长的选择:吸取0.1m g/mL葡萄糖标准品溶液0.6mL,加蒸馏水至1mL,在冰水浴中加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6mL,混匀,沸水浴10m in,冷水浴冷却;以相应溶液作为空白对照,于500~ 700n m波长范围内扫描。
按最大吸收波长项下的测定方法,进行标准曲线的制作、精密度试验、重现性试验、稳定性试验和加样回收率试验。
1.2.3.3 3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)[6,10] 最大吸收波长的选择:吸取1mg/mL葡萄糖标准品溶液0.6mL,加蒸馏水至1mL,加入DNS溶液2mL,混匀,沸水浴5m i n,冷水浴冷却后,加入9mL蒸馏水;以相应溶液作为空白对照,于400~600n m波长范围内扫描。
标准曲线制作:分别吸取1mg/mL葡萄糖标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL各3份,按最大吸收波长项下方法测定,以浓度(C)为横坐标,吸光度(D)为纵坐标,绘制标准曲线。
使用胞内还原糖水溶液(稀释5倍)和胞外还原糖水溶液,按最大吸收波长项下的测定方法,进行精密度试验、重现性试验、稳定性试验和加样回收率试验。
1.2.3.4 费林滴定法[10-11] 空白滴定:吸取费林甲、乙液各5mL于250mL锥形瓶中,加入蒸馏水10mL及1mg/mL葡萄糖标准溶液9mL,加热至沸腾,保持30s,趁热以每2s1滴的速度滴加葡萄糖标准溶液,至溶液蓝色刚好褪去为终点,记录消耗葡萄糖标准溶液体积(V0)。
样品滴定:吸取费林甲、乙液各5mL于250mL锥形瓶中,加蒸馏水10mL及胞内还原糖或胞外还原糖样品稀释液5mL,滴定管加入比预备滴定量少0.5mL左右的葡萄糖标准液,摇匀后加热至沸腾,保持30s后匀速滴入葡萄糖标准液,至蓝色刚好褪去为终点,记录消耗葡萄糖标准溶液体积(V)。
还原糖(m g/mL)=(V0-V) 葡萄糖标准液浓度/参加反应的样液量 样品稀释倍数重现性试验:分别取5mL胞内还原糖水溶液(稀释5倍)和胞外还原糖水溶液各5份进行滴定,记录每次耗用的葡萄糖标准液的量。
加样回收率试验:样品滴定时,在加入费林甲、乙液各5mL及蒸馏水10mL后,再加入胞内还原糖水溶液(稀释5倍)或胞外还原糖水溶液5mL+葡萄糖标准溶液1mL,然后进行滴定操作,重复5次,记录每次葡萄糖标准液的用量。
1.2.4 数据处理 试验数据均采用Excel进行处理分析。
2 结果与分析2.1 苯酚-硫酸法最大吸收波长的选择:测得最大吸收波长为485nm。
标准曲线制作:绘制标准曲线,得回归方程为y= 0.0082x+0.0352(r2=0.9996),表明葡萄糖浓度在5~ 100 g/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
精密度试验:测得吸光值分别为0.376、0.375、0.377、0.376、0.376,平均值为0.376,RSD=0.188%,表明仪器的精密度良好。
重现性试验:对于胞内多糖,根据测得的吸光值计算得烘干菌丝体中多糖(以葡萄糖计)含量分别为0.182、0.179、0.177、0.174、0.170g/g,平均值为0.176g/g,RSD= 2.743%,表明该方法重现性良好;对于胞外多糖,根据测得的吸光值计算得液体培养基中多糖(以葡萄糖计)含量分别为21.659、26.780、23.610、25.073、22.878 g/mL,平均值为24.000 g/mL,RS D=8.275%,表明该方法重现性不好。
稳定性试验:对于胞内多糖,测得的吸光值分别为0.392、0.393、0.392、0.391、0.391,平均值为0.392,RS D=0.214%,表明胞内多糖溶液的测定在2h内基本稳定;对于胞外多糖,测得的吸光值分别为0.138、0.139、0.139、0.137、0.137,平均值为0.138,RSD=0.725%,表明胞外多糖溶液的测定在2h 内基本稳定。
