实验四.细菌芽孢染色一. 目的要求：目的：掌握细菌芽孢染色方法内容：１．学习并掌握芽孢染色法２．初步了解芽孢杆菌的形态特征二. 基本原理：芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。
因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。
三. 器材1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃）2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液石炭酸复红染液0.05%碱性复红蒸馏水3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等二甲苯.香柏油四. 操作步骤：一）方法1：1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。
2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗.6.制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色，菌体呈红色。
二）方法2：1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。
2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min .4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。
5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
6.加复染液染2-3分钟，水洗。
7.干燥后用油镜观察，芽孢绿色，菌体红色。
五.实验报告：1.绘图：枯草杆菌的芽孢形态，芽孢的着色位置。
⼤⼆下--微⽣物学实验总结实验⼀、常⽤培养基配制⼀、器⽫清洗1、试管、培养⽫、三⾓瓶、烧杯等玻璃器⽫的清洗⽤瓶刷或海绵沾上洗⾐粉等洗涤剂刷洗，然后⽤⾃来⽔充分冲洗⼲净。
热的肥皂⽔去污能⼒更强，可有效地洗去器⽫上的油污,去离⼦⽔润洗，倒置晾⼲或烘⼲。
2、全⾃动实验室玻璃器⽫清洗机预清洗洗涤剂清洗⾃来⽔冲洗纯⽔冲洗 135℃⾼温⼲燥消毒3、装有固体培养基的器⽫应先将其刮去，然后洗涤。
带菌的器⽫在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25％新洁尔灭（苯扎溴铵）消毒液内24⼩时或煮沸半⼩时，再⽤上法洗涤。
带病原菌的培养物最好先⾏⾼压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进⾏洗涤。
⼆、载玻⽚与盖玻⽚的清洗⽤过的载玻⽚与盖玻⽚如滴有⾹柏油，要先⽤皱纹纸擦去或浸在⼆甲苯内摇晃⼏次，使油垢溶解，再在肥皂⽔中煮沸5～10分钟，⽤软布或脱脂棉花擦试，⽴即⽤⾃来⽔冲洗，最后⽤蒸馏⽔润洗数次，待⼲后浸于95％酒精中保存备⽤。
使⽤时在⽕焰上烧去酒精。
三、器⽫包扎1、培养⽫的包扎培养⽫常⽤⽜⽪纸密密包紧，⼀般以5～8套培养⽫作⼀包，包好后进⾏灭菌。
2、试管和三⾓烧瓶等的包扎试管和三⾓瓶盖上铝帽或者塑料帽后⽤⽜⽪纸包扎，进⾏灭菌。
包纸的⽬的在于保存期避免灰尘侵⼊。
四、器⽫清洗和包扎⼩结微⽣物学实验室所⽤的玻璃器⽫的质量要求硬质玻璃，能承受⾼温和短暂烧灼⽽不致破损；器⽫的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器⽫的形状和包扎⽅法的要求，以能防⽌污染杂菌为准；洗涤⽅法不恰当也会影响实验结果。
因此，在实验准备的时候要严格按照要求洗涤实验器⽫。
包扎并灭菌后备⽤。
五、培养基配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基（培养⼀般细菌⽤）⽜⾁膏 3g 蛋⽩胨 10g NaCl 5g 琼脂 15～20g ⽔ 1000ml实验原理：在配制固体培养基时要加⼊⼀定量琼脂作凝固剂。
琼脂在常⽤浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微⽣物分解利⽤。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和⽓温的不同⽽有所不同。
微生物学实验报告(格式标准)(生命科学专业)教师:黎勇目录索引实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测与分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科实验日期: 指导教师:黎勇实验一油镜的使用与细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1、 N·A=n·sinα2、 D=λ/2N、A3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。
4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕:(一) 油镜的使用镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。
(二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察(三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。
