实验五、细菌的芽孢染色法

姓名：学号：班级：12级生物基地4组别：周三第六大组时间：2013.10.18细菌芽孢染色一．实验目的1. 学习掌握芽孢染色法，了解芽孢的形态特征。

2. 巩固显微操作技术及无菌操作技术。

二．实验原理细菌芽孢染色的基本原理：芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。

细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。

利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。

再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。

在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。

芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。

常见的细菌芽孢形态和着生位置如下图所示：三．实验器材1、菌种：枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，牛肉膏培养基。

2、溶液和试剂：a) 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，蒸馏水等。

b) 香柏油、二甲苯。

3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、电子天平、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、锥形瓶等。

四．操作步骤1. 实验流程图：涂片→加热干燥固定→孔雀绿覆盖→微热5min→冷却→水洗→番红复染→水洗干燥→镜检2. 详细步骤：a) 涂片，加热干燥及固定：在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。

然后按照常规方法加热干燥及固定；b) 孔雀绿加热染色：用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；c) 水洗：水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。

实验四.细菌芽孢染色一. 目的要求：目的：掌握细菌芽孢染色方法内容：１．学习并掌握芽孢染色法２．初步了解芽孢杆菌的形态特征二. 基本原理：芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。

因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。

三. 器材1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃）2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液石炭酸复红染液0.05%碱性复红蒸馏水3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等二甲苯.香柏油四. 操作步骤：一）方法1：1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。

2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗.6.制片干燥后用油镜观察。

芽孢呈绿色，菌体呈红色。

二）方法2：1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。

2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min .4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。

5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

6.加复染液染2-3分钟，水洗。

7.干燥后用油镜观察，芽孢绿色，菌体红色。

五.实验报告：1.绘图：枯草杆菌的芽孢形态，芽孢的着色位置。

实验五——细菌芽孢染色山东大学生命科学学院09级四班张行润200900140177 摘要细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。

芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽孢染色法都基于一个原则：除了用着色强的染料外，还须要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

关键词芽孢（gemma of a fungus）芽孢染色法（Spore staining）复染（counterstain）前言细菌的芽孢的某些细菌的特殊结构。

芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或椭圆形的休眠体，它对不良环境具有很强的抗性。

在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。

芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴定细菌的重要依据。

在一般实验室中通常用芽孢染色法来观察其形态。

此外，由于芽孢具有很强的抗性，因此在生产实践中都以是否有杀死抗性最强的芽孢来评定高温灭菌及某些化学杀菌剂的效果。

一、实验目的1.学习并掌握芽孢染色法2.了解芽孢杆菌的形态特征3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，液被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。

细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。

利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。

细菌的芽孢染色姓名：俞华军班级：09生科三班学号：200900140157 日期：2010/10/29 组别：四同组者：谢英健余振洋岳永胜张刚刚一．实验目的1．学习并掌握细菌的芽孢染色法。

2．了解并观察细菌芽孢的结构和形态。

二．实验原理芽胞又称内生孢子，能否形成芽孢及芽孢的形状、芽孢在孢囊的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

芽胞壁厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状），而一旦染上色后又难以脱色。

芽胞染色法：根据芽胞特点设计，除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。

当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

三．实验器材1．菌种：枯草芽孢杆菌（芽孢位于菌体中央）、梭状芽孢杆菌（中部膨大）。

2．溶液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇。

3．器材：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。

四．实验步骤1．制片取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌（梭状芽孢杆菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可。

并按常规方法干燥、固定（每隔几秒在酒精灯火焰上过一遍）。

2．加热染色向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽（此时开始计时）并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

3．脱色带玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

4．复染用0.5%的番红水溶液复染1.5min。

5．水洗用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

6．镜检带载玻片自然干燥后（可在酒精灯火焰上每隔几秒过一遍）油镜镜检，观察芽孢的形态并绘图。

五．实验结果记录枯草芽孢杆菌10×100（油镜）梭状芽孢杆菌10×100（油镜）表一细菌形态记录表六．思考题1．为什么芽孢染色法需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？答:因为与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，而加热时芽孢的通透性高，此时染液可以进入从而使芽孢着色，而简单染色法不能使芽孢染色，所以不能看到。

1. 掌握芽孢染色的原理和方法。

2. 观察和区分芽孢与菌体的形态结构。

3. 理解芽孢在细菌生存过程中的重要性。

二、实验原理芽孢是细菌在恶劣环境下形成的一种特殊休眠体，具有厚而致密的壁，通透性低，对高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。

因此，在常规染色方法中，芽孢不易着色或仅显淡色。

芽孢染色法利用芽孢与菌体对染料的亲和力不同，采用特殊染色方法，使芽孢和菌体呈现不同的颜色，便于区分。

三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 染料：孔雀绿染液、番红染液、复染液（如石炭酸复红液和吕氏美蓝液）3. 仪器：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、滴管等四、实验步骤1. 将枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂平板，培养24小时。

2. 将培养好的菌落挑取少许，制作成涂片。

3. 将涂片用火焰固定。

4. 将涂片滴加孔雀绿染液，染色5-10分钟。

5. 水洗涂片，去除多余的染料。

6. 将涂片滴加番红染液，复染1-2分钟。

7. 水洗涂片，去除多余的染料。

8. 将涂片滴加复染液，染色1-2分钟。

9. 水洗涂片，去除多余的染料。

10. 将涂片晾干，用显微镜观察。

在显微镜下观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色。

芽孢直径大于菌体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈梭状。

六、实验分析1. 芽孢染色法是一种特殊的染色方法，可以有效地观察和区分芽孢与菌体的形态结构。

2. 芽孢是细菌在恶劣环境下形成的一种特殊休眠体，具有厚而致密的壁，对各种不利因素具有很强的抵抗力。

3. 芽孢在细菌的生存过程中具有重要意义，可以保护细菌度过恶劣环境。

七、实验讨论1. 在实验过程中，染色时间和染液浓度对实验结果有一定影响，需要根据实际情况进行调整。

2. 芽孢染色法可以应用于多种细菌的芽孢观察，如枯草芽孢杆菌、梭菌等。

3. 芽孢染色法是一种基础实验技术，对于微生物学学习和研究具有重要意义。

八、实验总结通过本次实验，我们掌握了芽孢染色的原理和方法，观察了芽孢与菌体的形态结构，了解了芽孢在细菌生存过程中的重要性。

实验九细菌的芽胞染色
实验目的：学习细菌的芽胞染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征。

实验原理：
细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。

芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。

当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

实验器材
1.菌种：培养36小时的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或者苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

2.溶液和试剂：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。

3. 仪器或其他用具：小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，显微镜等。

实验内容：
1.改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
（1）制备菌悬液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。

（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

芽孢、荚膜和鞭毛染色，都是利用细菌细胞不同的构造部分与染料的亲和力不同，用各种特殊染色法使之显示出不同的颜色，籍以显微观察。

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别，芽孢壁厚，透性低，着色，脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料—孔雀石绿在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色；而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（沙黄）进行复染色，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色。

使之显示出不同的颜色，籍以显微镜观察。

荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成份是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景染色而把不着色透明的荚膜衬托出来，荚膜很薄，易变形，因此制片时一般不用热固定。

细菌的鞭毛极为纤细，直径在0.1微米以下，因此在普通光学显微镜下不能见到，只有用特殊的染色方法，才能把鞭毛显示出来，鞭毛的染色方法很多，但主要的原理都是采用不稳定的胶体溶液作媒染剂，在鞭毛上生成沉淀，加大鞭毛的直径，然后再进行染色，同时，培养稍久的菌，鞭毛易脱落，所以要用新鲜的菌体，一般是用经3~5代（每代培养时间16~20小时）的斜面，最后一代接到含0.8~1.2%琼脂的软琼脂培养基（带有冷凝水）经12~16小时培养的菌体为佳。

三、实验材料和用具：1．菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）园褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）普通变形杆菌（Proteus vulgaris）萤光假单胞菌（Pseudomonas fluoroscens）丙酮丁醇梭状芽孢杆菌（Clostridium acetobutylicum）苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）北京棒状杆菌Asl.299（Corynebacterium pekinense）2．染液：（配方见附录Ⅰ）（1）芽孢染液：A、5%孔雀石绿水溶液B、0.5%沙黄水溶液（2）荚膜染液：34A、石碳酸复红染液B、5%黑色素水溶液（或用墨汁）（3）鞭毛染液：硝酸银染色：A液：鞭毛染色媒染剂B液：硝酸银溶液美蓝染色：媒染剂：同硝酸银染色A液美蓝染色液3．用具：显微镜、载玻片、玻片架、滤纸、接种环、无菌水、酒精灯、香柏油、二甲苯、火柴、擦镜纸等。

【实验题目】细菌芽孢染色【实验目的】1. 学习并掌握芽孢染色法2. 了解芽孢的形态特征【实验器材】1、菌种：枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

2、溶液和试剂：a) 5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水b) 香柏油、二甲苯3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等【实验原理】芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。

在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。

是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。

利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

【实验内容及步骤】2、具体步骤：1)洗片、干燥取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。

干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。

方便以后水洗染料，避免洗去细菌。

2)涂片取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）3)加热固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；4)染色向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌位置，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5min，加热时注意补充染液，切勿涂片干涸。