姓名班级13级生命基地班学号同组者：
科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
【实验题目】
细菌芽孢染色
【实验目的】
1.学习并掌握芽孢染色法
2.了解芽孢的形态特征
【实验器材】
1、菌种：
枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2、溶液和试剂：
a) 5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水
b) 香柏油、二甲苯
3、仪器及其它用品：
普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等
【实验原理】
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。
与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
【实验内容及步骤】
2、具体步骤：
1)洗片、干燥
取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。方便以后水洗染料，避免洗去细菌。
2)涂片
取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）
3)加热固定
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科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；
4)染色
向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌位置，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5min，加热时注意补充染液，切勿涂片干涸。
5)脱色
冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水为无色。
6)复染
用0.5%的番红水溶液复染2min。
7)水洗
用缓流自来水冲洗至流出水为无色。
8)干燥镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。
【结果分析】
1、染色结果
镜检观察，芽孢呈绿色，菌体为红色。枯草芽孢杆菌菌体形态为短杆状，末端钝圆，单生或形成短链，芽孢呈椭圆状，位于菌体中央或稍偏，含芽孢菌体不膨大（见图1）。
梭装芽孢杆菌芽孢呈圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于菌体中央或极端，使菌体膨大呈梭状（见图2）。
芽孢染色结果
菌种名称菌体颜色芽孢颜色芽孢形状芽孢囊形状芽孢着生位置
枯草芽孢杆菌红色绿色椭圆或柱状圆形不膨大中央或稍偏
梭状芽胞杆菌红色绿色圆形或卵圆
形膨大呈梭状中央、极端或次
极端
姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
图1：枯草芽孢杆菌
图2：梭状芽胞杆菌
姓名班级13级生命基地班学号同组者：
科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
2、实验结果分析
在观察枯草芽孢杆菌芽孢时，发现有些部位孔雀绿水溶液染色较浅，影响观察。
以后实验中应注意孔雀绿水溶液加入的量，及加热时间，防止染色程度不够，同时
也应避免染色程度过深，多余染液不易完全洗去,影响观察。
在今后的芽孢染色实验中应注意以下几点：
1、选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂；
2、加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破
裂
3、加热染色时控制好时间，加热不够则芽孢难以着色；时间过长会使染色过深，
不易洗脱
4、脱色时必须等待玻片冷却以后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。【思考与讨论】
1、为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽胞？
细菌的芽孢壁较厚,对染料的通透性差,不易着色，在加热的过程中，芽孢的渗透性会发生变化，染液能顺利渗透进入芽孢，使染色效果更佳，所以芽孢染色需要加热。
不能用简单染色法进行芽孢染色。因为简单染色法没办法给芽孢着色，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。
2、若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。
A)可能该细菌培养时间过长，已到达生长的中后期，随着环境中营养物质的消耗，以及细菌代谢产物的积累，使得环境越来越不利于生长，因此产生大量的芽孢以度过不良环境。
B)可能是在用孔雀绿染色后，水洗时没有洗净，细胞还是孔雀绿的颜色。
C)可能是在用番红水复染时，染色时间过短，没有染色成功。
3、用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？
脱色必须等玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。
