EST或转录组分析

转录组分析流程范文转录组分析是一种用于研究特定生物体或组织中的全部转录本的方法。

它通过测量RNA分子在特定时间点和条件下的表达水平，揭示了基因转录的调控机制，功能注释和转录本的表达图谱，并为找到新的基因和功能注释提供了线索。

下面是一个常用的转录组分析流程，包含预处理、质控、序列比对、表达定量和差异分析等步骤。

1.数据预处理：数据预处理主要包括质量控制和去除低质量序列。

在高通量测序中，原始的测序数据通常包含低质量碱基、接头序列和多聚A/T等噪声。

质控工具如FastQC可以用于评估测序数据的质量，根据其结果，采用切割、修剪、过滤和去除低质量序列来提高数据质量。

2.序列比对：序列比对是将预处理后的测序数据与参考基因组进行比对的过程。

常用的比对工具包括Bowtie、BWA和STAR等。

这一步的目的是将测序数据映射到参考基因组上，以确定每个读取序列的起始位置。

3.表达定量：表达定量是将比对得到的序列转化为表达量的过程，它衡量了每个转录本的相对丰度。

常用的表达定量工具包括HTSeq、Cufflinks和Salmon 等。

这些工具通过计算每个转录本对应的读取数来估计其表达水平，并生成基因表达矩阵。

4.差异表达分析：差异表达分析是比较不同条件下的基因表达量，以确定哪些基因在不同条件下的表达水平发生了显著变化。

常用的差异表达分析工具包括DESeq2、edgeR和limma等。

这些工具通过统计学方法来鉴定不同条件之间的显著差异，并生成差异表达基因列表。

5.功能注释：功能注释是对差异表达基因进行生物学功能注释的过程。

常用的功能注释工具包括DAVID、GOseq和KEGG等。

这些工具通过富集分析、与已知数据库的比对和基因网络分析等方法，帮助研究人员了解差异表达基因的功能和参与的生物学过程。

6.结果可视化：结果可视化是将转录组分析结果以图形化的形式呈现，以帮助研究人员理解和解释数据。

常见的结果可视化工具包括Heatmap、Venn图、火山图和基因网络图等。

水产动物基因转录组学研究进展摘要：我国作为最大的发展中国家和传统的农业大国，农业有着巨大的应用空间和广阔的发展前景。

而在农业中，水产方面又是一大类重要的发展方面。

近年来，水厂养殖相关技术不断更新发展，我国的水产行业发展水平日新月异，而在相关研究中，分子生物学与水产的结合吸引了更多人的目光。

本文将就分子生物学与水产养殖的结合进行综述，主要方面为外界环境条件改变、饲料营养成分改变对基因表达的影响以及转录组学技术在水产动物研究中的应用。

关键词：水产养殖；分子生物；基因表达；转录组学1 基因转录组学在水产动物研究中的应用近年来，转录组学技术及其在水产动物中的研究备受研究者的广泛关注。

转录组学技术主要有基于杂交技术和测序技术为基础的两大类技术; 两类技术在水产动物的转录组学研究中均得到了广泛运用。

以下就近年来水产动物在免疫应答、生长发育、生物进化和毒理学方面的转录组学研究进展进行整理。

转录组学、基因组学和蛋白质组学等各种组学技术在揭示水产动物抗病免疫、生长发育、系统进化和生物毒理过程及相应机理方面的研究中越来越重要。

通过组学研究，可以深刻理解水产动物各种生命活动规律的内在联系和分子机制，并根据相应结果进一步运用到抗病育种、药物筛选、种质资源保护和环境监测等多个研究领域。

转录组学是研究特定细胞、组织或器官在特定生长发育阶段或某种生理状况下所有转录本的科学。

这所有的转录本就称之为转录组，包括编码蛋白质的mRNA和非编码RNA( rRNA，tRNA和其他ncRNA)。

与基因组相对稳定不同的是，转录组是随着生长发育阶段、生理状态和外界环境的改变而变化的。

因此，转录组分析成为研究生物生长发育、应激生理、抗病免疫等作用机制的有力工具。

依据转录组学技术原理的不同，可以将其划分为两类技术，一种是基于杂交的转录组学技术，如利用cDNA微阵列(cDNA microarray) 和DNA宏阵列( DNA macroarray) 进行检测的转录组学技术; 一种是基于测序的转录组学技术，如cDNA 文库或表达序列标签( expressed sequence tags，EST) 文库测序技术，基因表达系列分析( serial analysis of gene expression，SAGE) 技术和大规模平行测序( massively parallel signature sequencing，MPSS) 技术，以及近年来发展起来的下一代高通量测序技术( next generation sequencing，NGS) ，即RNA测序( RNA sequencing，RNA-seq) 技术等。

表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。

这一概念首次由Adams等于1991年提出。

近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。

在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。

而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。

文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。

因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。

Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。

虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。

Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。

基于转录组测序的油梨EST-SSR引物开发应东山;唐浩;韩瑞玺;王文林;王明;王琴飞;汤秀华;张如莲【摘要】利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列(EST-SSRs),为SSR标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础.采用Illumina二代测序的技术,共获得37639条无冗余的序列,对其进行SSR搜索,共获得6419条简单序列重复(SSR).利用Primer 3.0软件设计SSR引物,并以11份油梨种质筛选多态性引物.基于转录组序列开发出的EST-SSR的分布频率为17.05％.在油梨EST-SSR中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的99.07％.单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的37.47％、31.80％和29.80％;出现频率最高的二核苷酸重复基元是AG/CT,占总数的29.15％,出现最高的三核苷酸重复基元为AAG/CTT,占12.01％.随机选择315个SSR位点合成引物,经11份油梨种质筛选鉴定,227对引物可扩增获得产物,有效扩增率为72.06％;其中34对引物表现出良好多态性,占有效引物的12.78％,占总引物的10.79％.在34对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数2～12个.利用高通量测序开发SSR引物有较好的实用性,开发获得的34个具有多态性的油梨SSR标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2018(039)012【总页数】6页(P2446-2451)【关键词】油梨;转录组;EST-SSR;引物【作者】应东山;唐浩;韩瑞玺;王文林;王明;王琴飞;汤秀华;张如莲【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口 571101;农业农村部科技发展中心,北京 100122;农业农村部科技发展中心,北京 100122;广西南亚热带农业科学研究所,广西龙州 532415;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口 571101;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口571101;广西南亚热带农业科学研究所,广西龙州 532415;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口 571101【正文语种】中文【中图分类】S31油梨（2n=24，Persea americana Mill.）是樟科（Lauraceae）油梨属常绿乔木果树，富含脂肪、热能高，故有“森林黄油”之美称，是重要的热带果树之一。

转录组测序技术的应用及发展综述摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。

RNA—Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段（reads）数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本;如果有基因组参考序列,可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。

文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA—Seq的研究平台，着重介绍RNA—Seq 的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA—Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。

关键词: RNA-Seq；原理应用；方法;挑战；发展前景Abstract：Transcriptome sequencing （RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome。

RNA—Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads）numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence，the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information，has been widely used in biological research，medical research，clinical research and drug development。

转录组分析的思路1.确定实验设计和样本预处理：-在实验设计时，需要根据研究目的选择不同的实验组和对照组，比如疾病组和对照组、药物处理组和非处理组等。

-样本预处理包括RNA提取和质量检测，确保RNA质量好、完整度高，并消除可能的污染。

2.RNA测序和数据处理：- RNA测序方法主要有RNA-Seq和微阵列芯片。

RNA-Seq方法能够对全转录组进行定量和定性分析，而微阵列芯片则可以同时检测上万个基因的表达水平。

在选择方法时需要考虑测序深度和数据量、所需分辨率等因素。

- 进行数据质量控制，如去除低质量的reads和PCR重复。

- 根据测序数据，可以使用不同的软件或方法，如Tophat、HISAT2、DESeq2等，对转录组数据进行比对、定量和差异表达分析。

3.差异表达基因分析：-差异表达基因分析是转录组分析的核心环节。

通过比较实验组和对照组的基因表达水平，可以筛选出差异表达的基因。

- 对于RNA-Seq数据，常使用DESeq2、edgeR、limma等软件进行差异表达基因分析。

- 对于微阵列芯片数据，常使用SAM、limma等软件进行差异表达基因分析。

-通过特征选择和差异分析，可以找出与研究对象相关的基因。

4.功能富集分析和生物学解释：-对差异表达基因进行功能富集分析，可以揭示差异表达基因在细胞过程、分子功能和信号通路等方面的富集情况。

- 常用的功能富集分析工具包括DAVID、GOseq、KEGG、Reactome等。

-通过生物学解释，可以从功能角度解释差异表达基因与研究目的之间的关系。

5.验证转录组分析结果：-通过实验验证转录组分析结果，可以提高分析结果的可靠性。

-常用的实验验证方法包括实时定量PCR(qPCR)、西方印迹、免疫组织化学等。

总结：转录组分析的思路包括实验设计和样本预处理、RNA测序和数据处理、差异表达基因分析、功能富集分析和生物学解释以及验证分析结果。

通过这一系列步骤，我们可以更好地理解基因在特定生物学过程中的表达调控和功能，为后续的研究提供指导。

转录组数据分析方法与应用随着高通量测序技术的广泛应用，越来越多的转录组数据被生成和收集，这些数据对于研究基因表达调控、发现新基因和新剪接变体、诊断疾病等方面具有重要意义。

因此，转录组数据分析已成为当前生物学研究中的重要方向之一。

而转录组数据分析的常用方法之一就是基于RNA-Seq技术的差异表达分析。

本文将从数据获取、数据预处理、差异表达分析、生物信息学工具及其应用等方面，探讨转录组数据分析的方法和应用。

一、数据获取转录组数据获取的最重要的技术手段是RNA-Seq。

RNA-Seq是一项革命性的技术，通过将参考基因组上的所有转录本进行定量分析，可以获得全转录组的基因表达谱，还可以识别新的基因、新的剪接变异、可变剪接事件等。

RNA-Seq技术最重要的是能够获得高通量的转录本序列信息，但与其他高通量技术相比，不同转录物的表达水平测定的相关性较弱，需要更多的样本。

除了RNA-Seq，核酸芯片技术也被广泛应用于转录组数据的获取。

二、数据预处理在进行差异表达分析之前，对于原始的转录组数据进行完整的质量评估和处理将产生重要的影响。

由于RNA-Seq是一种PCR扩增技术，测序错误率是非常高的，为了避免这些错误对研究的影响，需要对原始数据进行筛选和过滤。

主要的处理过程包括：去除低质量序列、去除未被测到的序列、去除重复序列、去除核酸污染物等。

三、差异表达分析差异表达分析是转录组研究的核心部分，通过比较样本之间的差异来对基因表达谱进行解释。

RNA-Seq数据的分析流程通常包含数据预处理、对数据进行比对和定量、根据基因显著性筛选差异表达基因、寻找差异表达基因与通路、功能的相关性及其下游效应等。

在对数据进行分析之前，需要首先对数据进行标准化处理，以消除影响分析结果的不必要因素。

标准化处理通常包括对数据进行正则化、去批次效应、去OTU效应等。

差异表达分析的步骤：1. 表达定量。

标准化RNA-Seq中的表达量是FPKM或者RPKM。