康柏西普眼用注射液
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康柏西普眼用注射液Kangboxipu Yanyong ZhusheyeConbercept Ophthalmic InjectionGRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG 50 KRIIWDSRKG FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID 100 VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR 150 DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY TCAASSGLMT KKNSTFVRVH 200 EKPFVAFGSG MESLVEATVG ERVRIPAKYL GYPPPEIKWY KNGIPLESNH 250 TIKAGHVLTI MEVSERDTGN YTVILTNPIS KEKQSHVVSL VVYVPPGPGD 300 KTHTCPLCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP 350 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 400 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG 450 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KATPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN 500 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK 526二硫键链内：27-76 121-182 340-400 446-50427'-76' 121'-182' 340'-400' 446'-504'链间：305-305' 308-308'N-糖基化位点：N33、N65、N120、N193、N249、N270、N376分子式：C5276H8298N1410O1566S36分子量：117.6 kDa本品系由可高效表达人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养、蛋白收获、纯化后获得的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白制成。
不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 工程细胞2.1.1 名称及来源康柏西普工程细胞由含有人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白基因的质粒转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞构建而成。
2.1.2 细胞库建立、传代及保存原始细胞传代，扩增后保存于液氮或-130℃以下，作为主细胞库。
从主细胞库的细胞传代，扩增后保存于液氮或-130℃以下，作为工作细胞库。
各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次,细胞库检定合格后方可用于生产。
2.1.3 主细胞库及工作细胞库的检定应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.3.1 细胞鉴别应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。
2.1.3.2 内、外源因子检查细菌和真菌、分枝杆菌、支原体、病毒因子检查应符合规定。
2.1.3.3 目的蛋白表达量测定表达量应符合批准要求。
2.1.3.4 目的基因核苷酸序列检查(工作细胞库可免做)目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。
2.2 原液2.2.1 细胞的复苏与扩增从工作细胞库来源的细胞复苏后，进行传代、扩增，供生物反应器接种用。
2.2.2 生产用细胞培养液生产用细胞培养液应不含任何血清和抗生素。
2.2.3 细胞培养采用经批准工艺进行细胞培养，收集含目的产物的培养液，即“收获液”。
细胞培养全过程应严格按照无菌操作。
2.2.5 分离纯化收获液采用经批准的工艺进行纯化和病毒灭活，制得高纯度的康柏西普蛋白，即为康柏西原液。
除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
2.2.6 原液检定按3.1项进行。
2.3 半成品2.3.1 配制与除菌按批准的工艺将原液用缓冲液稀释，除菌过滤后即为半成品。
2.3.2 半成品检定按3.2项进行。
2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”有关规定。
2.4.2 分装应符合“生物制品分装和冻干规程”、通则0102及通则0105规定。
2.4.3 规格10mg/ml，0.2ml/支。
2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程”、通则0102及通则0105规定。
2.4.5 成品检定按3.3项进行。
3 检定3.1 原液检定3.1.1 鉴别试验3.1.1.1 肽图依法检查（通则3405第一法）。
取供试品适量（约相当于0.2mg蛋白质），加入表面活性剂、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液和50 mmol/L碳酸氢铵溶液，煮沸10分钟变性还原，冷却后加入1mol/L碘乙酰胺（IAA）溶液室温避光封闭45分钟。
用50 mmol/L碳酸氢铵超滤换液，按照1:25（mg/mg）加入测序级胰蛋白酶，37±1℃酶切16~20小时，加入10%三氟乙酸终止，12000g离心5分钟（2-8℃），取上清液作为供试品溶液。
色谱柱为碳十八反相色谱柱（如2.1×150 mm，粒度1.8 μm色谱柱或其他适宜的色谱柱），柱温60℃；流速为每分钟0.2 ml；检测波长214 nm；取适宜体积注入超高效液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱（表中流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.085%三氟乙酸-乙腈溶液）。
标准品同法操作。
时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0 98 25 94 665 64 3670 40 6078 20 8080 98 295 98 2供试品肽图应与康柏西普标准品一致。
3.1.1.2 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）使用氨基酸序列分析仪或质谱法测定，N端序列应为：Gly-Arg-Pro-Phe-Val-Glu-Met-Tyr-Ser-Glu-Ile-Pro-Glu-Ile-Ile。
3.1.1.3 分子量依法检查（通则0541第五法）。
使用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为10％，加样量2 μg。
分子量应为67.0～81.8 kD。
3.1.1.4 电荷异质性用还原固定pH梯度-等电聚焦法测定。
取供试品适量（约相当于0.18mg-0.25mg蛋白质）加入8mol/L尿素-100mmol/LTris-HCl (pH 8.0)溶液、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液，37℃还原3 h，冷却后加入0.5mol/L碘乙酰胺（IAA），室温避光封闭1 小时。
用8 mol/L尿素超滤换液，之后加入溶胀液混匀后，加入电泳槽，取固定pH梯度胶条浸入其中，水化5小时。
标准品同法操作。
按下表程序进行等电聚焦。
等电聚焦电压（V）时长（小时）30 6500 11000 18000 4供试品电荷异质性应与标准品基本一致。
3.1.2 纯度和杂质3.1.2.1 电泳法依法检查（通则0541第五法）。
使用还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为10％，加样量4 μg。
主峰面积百分比应不低于96.0％。
3.1.2.2 高效液相色谱法依法检查（通则0514）。
采用亲水硅胶体积排阻色谱柱（如7.8×300 mm，粒度5 μm 色谱柱或其他适宜的色谱柱），流动相为20 mmol磷酸氢二钠-150 mmol/L氯化钠-200 mmol/L精氨酸缓冲液，pH 7.2±0.1，流速为每分钟0.5ml，检测波长为280 nm，上样量为50~200 μg。
按面积归一化法计算纯度，康柏西普主峰面积应不低于总面积的98.0％。
3.1.2.3 宿主细胞DNA残留量依法检查（通则3407第三法）。
每1 mg康柏西普应不高于30 pg。
3.1.2.4 宿主细胞蛋白残留量依法检查（通则XXXX）。
用经验证的酶联免疫法测定，每1 mg康柏西普应不高于30 ng。
3.2.1.5 Protein A残留量依法检查（通则XXXX），用经验证的酶联免疫法测定，每1 mg康柏西普应不高于20 ng。
3.1.3 效价3.1.3.1 生物学活性依法检查（通则XXXX），相对生物学效价应为标准品的60%~140%。
3.1.3.2 相对亲和力依法检查（通则XXXX），相对亲和力应为标准品的60%~140%。
3.1.4 蛋白质含量依法检查（通则731第六法）。
用消光系数法测定，以供试品缓冲液作为空白，测定供试品溶液在波长280 nm处吸光度，按下列公式计算供试品蛋白质含量，蛋白质含量应不低于10.0 mg/ml。
公式：蛋白质含量(mg/ml) = (OD280×n)/(E×L)式中：OD280为供试品溶液在波长280 nm处吸光度；n为稀释倍数；E为康柏西普蛋白的消光系数，1.175 ml/(mg∙cm)；L为光程，cm。
3.1.5 糖谱依法检查（通则0512），离子交换色谱法。
取供试品适量（约相当于0.8mg-1.0mg 蛋白质），加水超滤换液，肽N-糖苷酶F （PNGase F ）37±1 ℃孵育，固相萃取后真空离心干燥，处理后样品加入2-氨基苯甲酰胺（2-AB ）标记液，65±1℃反应3~3.5小时，固相萃取真空离心干燥，加水复溶作为供试品溶液。
色谱柱为阴离子交换柱（如2.1 × 250 mm ，粒度5 μm 色谱柱或其它适宜的色谱柱）；柱温为室温；流速为每分钟0.2ml ；荧光激发波长为330 nm ，荧光发射波长为420 nm ；取适宜体积供试品溶液注入超高效液相色谱仪；按下表进行梯度洗脱（表中流动相A 为20%乙腈水溶液，流动相B 为200 mmol/L 甲酸铵-20%乙腈水溶液）。
按照面积归一化法计算各N-糖型比例。
时间（分钟）流动相A （%）流动相B （%）0 100 0 5 100 0 35 0 100 40 0 100 41 100 0 60100按下列公式计算供试品Z 值，Z 值应为0.80~1.50。
Z 值 =∑=⨯41)(i i i 个唾液酸的峰面积比例含式中：含i 个唾液酸的峰面积比例 =∑=41)(n n i 个唾液酸峰面积含个唾液酸峰面积含3.1.6 唾液酸含量依法检查（通则0512），反相色谱法。
取供试品适量（约相当于1.1mg-1.3mg 蛋白质），加水超滤换液后，加入5 mol/L 乙酸溶液混匀。
在唾液酸对照品系列稀释液中加入5 mol/L 乙酸溶液混匀。
上述溶液置80±2 ℃加热2~2.5小时，加入4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺（DMB ）标记液50±1℃反应3~3.5 小时，加水稀释标记后的样品。
