固定化乳糖酶制备低乳糖牛奶的研究进展

固定化酶在食品中的应用（生物科学与技术学院袁定清）摘要:固定化酶技术将酶工程提高到一个新水平，实现了酶的重复使用及产物与酶的分离。

而且它已在食品领域得到了迅速的发展和广泛的应用。

本文主要介绍了固定化酶技术的特点、固定方法、食品工业方面的应用和发展趋势的预测，是酶工程的核心技术之一。

关键词：固定化酶；食品制造；固定化技术Application of immobilized enzyme in food(College of biological science and technology Yuan Dingqing ）Abstract:The technology of immobilized enzyme is one of the core technology for enzyme engineering, it enzyme engineering to a new level, to achieve the separation of enzyme reuse and product with the enzyme. And it has been in the food area of rapid development and wide application. This paper describes the characteristics of the immobilized enzyme technology, fixation methods, applications and development trends in the food industry forecast.Key words:immobilized enzyme; food industry; immobilization technology; prospects1 固定化酶的定义和特点固定化酶技术是用人工方法将酶固定在特定载体上，进行催化生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶，与水溶性酶相比，其优点如下：易于将固定化酶与底物、产物分离，便于后续的分离和纯化；可以在较长时间内连续生产；酶的稳定性和最适温度提高；酶反应条件容易控制；可以增加产物的收率提高产物质量；酶的使用效率高，成本低；适于产业化、连续化、自动化生产。

西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘 虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要 酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词 酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法 京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t 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一、实验目的1. 了解乳糖酶的性质和作用。

2. 掌握乳糖酶固定化的基本原理和方法。

3. 研究不同固定化方法对乳糖酶活性的影响。

4. 探讨固定化乳糖酶在乳糖水解中的应用。

二、实验原理乳糖酶（β-半乳糖苷酶）是一种能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖的酶。

乳糖不耐受症患者由于体内缺乏乳糖酶，无法消化乳糖，导致食用乳制品后出现腹胀、腹泻等症状。

固定化乳糖酶可以克服传统酶制剂的缺点，如酶活性不稳定、易失活等，从而提高乳糖水解效率。

本实验采用化学结合法将乳糖酶固定化在载体上，通过比较不同固定化方法对酶活性的影响，筛选出最佳的固定化方法。

三、实验材料与仪器材料：1. 乳糖酶2. 载体：壳聚糖、明胶、海藻酸钠3. 乳糖4. 磷酸盐缓冲液5. pH计6. 离心机7. 酶标仪仪器：1. 烧杯2. 移液器3. 恒温水浴锅4. 电子天平5. 显微镜四、实验步骤1. 乳糖酶溶液的制备：将乳糖酶用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的酶溶液。

2. 载体的制备：a. 壳聚糖：将壳聚糖用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。

b. 明胶：将明胶用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。

c. 海藻酸钠：将海藻酸钠用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。

3. 乳糖酶固定化：a. 壳聚糖固定化：将壳聚糖溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。

b. 明胶固定化：将明胶溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。

c. 海藻酸钠固定化：将海藻酸钠溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。

4. 固定化酶的活性测定：将固定化酶分别与乳糖溶液混合，在一定条件下进行水解反应，通过测定水解产物的浓度来计算酶的活性。

5. 结果分析：比较不同固定化方法对乳糖酶活性的影响，筛选出最佳的固定化方法。

五、实验结果与分析1. 固定化酶的活性：通过实验发现，壳聚糖固定化酶的活性最高，明胶固定化酶的活性次之，海藻酸钠固定化酶的活性最低。

一种新型乳糖酶在制备低乳糖牛奶中的应用研究
侯重文;刘飞;钊倩倩;袁超;朱希强
【期刊名称】《食品与药品》
【年(卷),期】2012(000)011
【摘要】目的通过检测一种新型乳糖酶在不同条件下对牛乳中乳糖的水解率,研究其在制备低乳糖牛奶的最适条件.方法产乳糖酶基因工程菌株发酵并提取乳糖酶,分别在10,25和37℃条件下按不同比例添加该新型乳糖酶液,使用HPLC检测其乳糖水解率.结果该酶在10℃(0.9%)水解率可达83%以上,25℃(0.9%)水解率93%以上,37℃(0.3%)水解率94%以上.结论该酶在低温下具有良好的乳糖水解率,在工业上具有广阔的应用前景.
【总页数】3页(P392-394)
【作者】侯重文;刘飞;钊倩倩;袁超;朱希强
【作者单位】山东福瑞达医药集团公司,山东济南 250101; 山东省生物药物研究院博士后科研工作站,山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南 250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南 250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南 250101
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925+.9
【相关文献】
1.用于低乳糖牛奶生产的乳糖酶添加剂候选菌株筛选及粗酶性质研究 [J], 李荷;张博;张敏文;顾取良
2.乳糖酶在生产低乳糖奶中的应用研究 [J], 孙国庆;史玉东;付治军;康小红;胡新宇;刘卫星
3.固定化乳糖酶制备低乳糖牛奶初步研究 [J], 姚学平
4.固定化乳糖酶制备低乳糖牛奶的研究进展 [J], 孙成行;陈历俊
5.一种新型乳糖酶在制备低乳糖牛奶中的应用研究 [J], 侯重文;刘飞;钊倩倩;袁超;朱希强
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乳糖酶的研究现状及应用进展摘要：本文主要介绍了乳糖酶的理化性质及分类，分离纯化方法，酶活力测定方法，还介绍了乳糖酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展。

ABSTRACT: This article mainly introduced physical and chemical properties, classification,the methods of separation and purification,the determination method of the enzyme activity,and also introduced application and the latest research progress of β-galactosidase in food and pharmaceutical field.关键词：乳糖酶分离纯化研究现状应用KEY WORD:β-galactosidase Separation and purification Research status Application前言：乳糖酶(lactase)也称为β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。

乳糖酶分布广泛，理化性质稳定，催化能力强，使得它在食品和医药领域有着广泛的应用，特别是在医药领域中，乳糖酶能够水解乳糖成半乳糖和葡萄糖，促进牛奶的被人体更好的吸收和利用以治疗“乳糖不耐症”。

当前，乳糖酶的固定化和基因方面的研究也相当热且研究成果显著。

这里介绍乳糖酶一些基本的理化性质，分离纯化和酶活力测定方法，还有乳糖酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展，通过这些介绍使得人们对乳糖酶有更加清晰和全面的认识。

1乳糖酶概述1.1乳糖酶分布乳糖酶(lactase)称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactohydrolase)，简称β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。

乳糖不耐受和解决方式的研究动态【指示性摘要】牛奶是蛋白质和钙的良好膳食来源，也是改善居民膳食结构的理想食物，可是由于我国居民乳糖不耐受多发等问题，阻碍了饮奶的推行。

笔者对乳糖不耐受的分型、诊断、发生情形和目前有关的研究进展进行了综述。

在我国，乳糖不耐受和乳糖酶缺乏以成人型乳糖酶缺乏为主，成人发生率为80%～100%，学龄儿童发生率也较高，超过80%。

由发酵乳和乳糖酶水解生产的低乳糖牛奶可能是目前解决乳糖不耐受和乳糖酶缺乏人群饮奶的较为有效的手腕。

研究乳糖酶水解低乳糖牛奶中营养成份的利用率和长期饮用成效，对改善我国居民的膳食和营养状况具有重大意义。

【关键词】乳糖不耐受；乳制品；动态；研究众所周知，牛奶富含优质蛋白质和钙、磷等多种矿物质，是改善人群膳食结构的理想食物。

学生饮用奶(学生奶)是由政府专项打算提供或通过学校途径专供给学生的奶制品。

通过实施学生饮用奶打算引导奶类消费，将有助于全面提高青青年躯体素养，改善全民的膳食结构，并推动中国农业结构的优化调整。

可是，由于我国居民乳糖不耐受(lactoseintolerance)发生率较高、缺乏科学饮奶知识，限制了国家学生饮用奶打算的开展和推行。

本文对乳糖不耐受和解决方式的研究进展综述如下。

1乳糖不耐受的分型乳糖不耐受是指由于小肠粘膜表面缺乏乳糖酶致使的乳糖消化和吸收障碍，并伴有腹胀、腹泻、腹痛等一系列临床病症。

若是仅有乳糖酶缺乏致使乳糖消化和吸收障碍而不显现临床病症，那么称为乳糖消化不良(lactosemaldigestion)、乳糖吸收不良(lactosemalabsorption)或乳糖酶缺乏(lactasedeficiency)。

依照发生的缘故，可将乳糖不耐受分为：先本性乳糖酶缺乏、成人型乳糖酶缺乏和继发性乳糖酶缺乏[1]。

其中，成人型乳糖酶缺乏是乳糖不耐受的要紧类型，一样以为其发生与饮食适应有关。

造成乳糖酶基因的表达随时刻的延长而慢慢关闭[2]，表现为随年龄增加，乳糖酶活性慢慢下降，直至消失，引发乳糖不耐受或乳糖吸收不良。

固定化乳糖酶在低乳糖乳制品中的应用文/景文娟 刘晓兰*（黑龙江齐齐哈尔大学食品与生物工程学院）摘要：乳糖不耐症及低乳糖乳制品口感问题是制约乳制品消费增长的重要因素。

通过固定化乳糖酶分解牛乳中的乳糖，同时调整配方，制备出口感佳、营养丰富、成本低的低乳糖乳制品。

结果表明，固定化后的乳糖酶在温度50.00～70.00 ℃、pH值6.7左右时，具有较高的酶活力，稳定性好，金属离子对固定化酶活力影响较小。

通过响应面法优化出制备低乳糖乳制品的最佳条件为：温度50.33 ℃，时间181.99 min，固定化乳糖酶添加量1.28 g/L，乳糖水解率为83.98%，固定化乳糖酶可重复使用8 次。

通过正交试验及感官评价，确认低乳糖乳制品的最佳添加剂配方为：玛卡粉0.08%，椰粉3.00%，乳清蛋白粉1.80%和果葡糖浆2.00%，为低乳糖乳制品的规模化生产奠定了基础。

关键词：固定化；乳糖酶；低乳糖；乳制品；水解率；配方牛乳是人们从大自然中获得的“最完美的天然食物”[1]，然而乳糖不耐症这一世界性问题已经成为制约乳制品消费增长的重要因素[2，3]，中国成人乳糖不耐症的比例为75.00%～92.00%[3～5]。

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23）能够水解牛奶中的乳糖，生成D-葡萄糖、D-半乳糖、低聚半乳糖[6]。

通过乳糖酶水解技术，研究、开发和生产低乳糖含量的乳制品，对解决现阶段乳糖不耐症问题，增加人均乳制品摄入量具有深远意义。

经调查，部分乳品企业通过在牛乳中直接添加乳糖酶的方式生产低乳糖乳制品，该方法存在乳糖酶无法回收，反应时间无法控制，乳糖酶用量大、生产成本高等缺点[7，8]，而乳糖酶的固定化有望解决上述问题。

固定化酶技术从1957年发展至今，已应用的固定化载体主要有海藻酸钠[9～13]、树脂[14～16] 、壳聚糖 [17～19]、纤维素[20～22]、磁性高分子微球[23]等。

酶工程在食品领域的应用研究进展摘要:20世纪70年代以来,基因工程与酶催化理论的结合给酶工程带来前所未有的生机。

应用基因工程技术可以生产出高效能、高质量的酶产品,多种类型的酶制剂(合成酶、抗体酶、分子印迹酶、化学修饰酶、杂合酶等)实现了产业化生产。

迄今从生物界已经发现了3 000多种酶,用于工业生产的有百余种,但在食品加工中应用的酶仅有几十种,因此,酶工程在保健食品加工中的应用尚存在有巨大的潜力。

人们将利用酶工程开发出更多的新一代功能食品以造福于人类。

本文浅述了酶工程技术,如酶的固定化技术的概念、性质及应用。

介绍了酶工程在食品加工、食品保鲜和食品分析与检测中的应用现状,并对酶工程的作用和发展作出了展望。

关键词:酶工程;固定化酶;食品加工技术前言工业化酶制剂的品质改良及新品种的开发是现代生物技术介入最多的一个领域,并已取得令人瞩目的成果。

80年代末,就已经开发出多种蛋白酶、脂肪酶,到目前为止,国际上工业用酶超过50多种。

酶制剂主要用于果汁、啤酒、葡萄酒、乳制品、甜味剂、淀粉加工、糖果、面包等的生产。

DNA重组技术对酶工业的渗透,导致了酶工业的飞跃,已有多个国家实现了β-淀粉酶的克隆化;日本经过质粒重组的嗜热芽孢杆菌蛋白酶的活力为原菌酶活力的18倍;利用DNA重组技术,使葡萄糖异构酶和木糖异构酶的活力提高了5倍[1]。

酶工程技术是利用酶和细胞或细胞器所具有的催化功能来生产人类所需产品的技术,包括酶的研制与生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造,以及生物传感器。

酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊蛋白质。

其催化作用的条件非常温和,可在常温、常压下进行,又有可调控性,食品工业是应用酶工程技术最早和最广泛的行业。

近年来,由于固定化细胞技术、固定化酶反应器的推广应用,促进了食品新产品的开发,产品品种增加,质量提高,成本下降,为食品工业带来了巨大的社会经济效益。

酶工程在食品加工中已经广泛应用。

乳糖酶水解生产低乳糖牛乳工艺的优化王晓哲;钱方;曹迪;牟光庆;姜淑娟【摘要】Optimization of milk hydrolysis conditions was carried out through mono-factor and orthogonal experiments. The results showed that: the optimal hydrolysis conditions of lactase was 40℃, enzyme dosage 2 500 U/L, time 2 h,and the hydrolysis rate achieves almost 74.5%.%研究低乳糖牛乳的生产条件.通过单因素分析和正交试验对牛乳的水解条件进行优化.结果表明,在加酶量2 500 U/L、水解温度40℃、水解2h时牛乳中乳糖水解效果最佳,水解率达到74.5％.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2013(029)002【总页数】3页(P183-185)【关键词】低乳糖乳;乳糖酶;水解率;水解条件【作者】王晓哲;钱方;曹迪;牟光庆;姜淑娟【作者单位】大连工业大学食品学院,辽宁大连116034【正文语种】中文牛乳含有能促进人类生长发育以及维持健康水平的必需营养成分，是一种重要的饮食资源[1]。

但由于牛乳中乳糖不易被消化、吸收，极易引发乳糖不耐受现象。

部分人群存在乳糖不耐症，是由于体内缺乏乳糖酶，食用乳或乳制品后会引发肠胀、排气增多、腹泻、腹痛等非疾病性胃肠症状。

据调查，亚洲人口中约有70%人群患有不同程度的乳糖不耐症，在美国也有1/3人群体内乳糖酶水平较低。

研究[2，3]显示中国成年人饮用牛奶后乳糖不吸收的发病率高达86.7%，不耐受指数为0.9。

生产提供低乳糖乳是解决乳糖不耐问题的有效途径。

低乳糖乳在国外已商业化生产，在中国则刚起步。

低乳糖乳的生产方式有多种，其中酶水解法生产是最具安全性、实用、有效的方法，且生产成本低，对拓展低乳糖乳的产业化生产有着很强的优势[4-6]。