酿酒酵母质粒的提取

酿酒酵母载体质粒
酿酒酵母载体质粒是指用于将目的基因引入酿酒酵母细胞中的质粒。

质粒是一种环状的双链DNA分子，可独立于染色体存
在并繁殖。

酿酒酵母载体质粒通常包含以下元素：
1. 原核起始子（promoter）：用于启动目的基因的转录，使其
产生蛋白质。

2. 选择性标记基因（selectable marker gene）：常用的选择性
标记基因包括对抗生素的抗性基因（如抗生素抗性基因）或与缺失酵母株的互补基因（如RNA聚合酶II基因）。

选择性标
记基因能够在酵母细胞中提供抗性，使得只有表达该基因的转化细胞能够生长。

3. 多克隆位点（multiple cloning site，MCS）：用于将目的基
因插入质粒中，一般由多个限制性内切酶切割位点组成，方便将外源基因插入质粒。

4. 酿酒酵母起始子（promoter）：用于应用在酿酒酵母细胞中
工作的目的基因。

5. 终止子（terminator）：用于终止目的基因的转录。

通过插入目的基因到酿酒酵母载体质粒中，并经由转化等方法将质粒引入酿酒酵母细胞中，可以使得酵母细胞表达目的基因，从而进行相应的功能研究和应用实验。

这种酿酒酵母载体质粒在酿酒酵母遗传工程中起到了重要作用。

酿酒酵母转化实验报告摘要本文介绍了酿酒酵母转化实验的实验步骤和实验结果。

首先，介绍了实验所使用的材料和器材，以及实验的准备步骤，包括菌株的提取、培养基的种植和抗生素的添加等。

其次，介绍了质粒转化的步骤，包括提取质粒、构建质粒等。

最后，介绍了实验结果，包括质粒转化后酵母菌株的抗性检测和质粒转化效率的估算等。

关键词：酿酒酵母，质粒转化，抗性检测，质粒转化效率1. 实验简介酿酒酵母转化实验是一种常用的基因工程实验，它是将外源基因转入酿酒酵母中，以改变酵母的生理特性和功能的一种方法。

通过质粒转化，可以将外源基因转入酿酒酵母，从而改变酵母的生理特性和功能，为酿酒酵母的改良和研究提供了便利。

2. 实验材料和器材（1）材料：酿酒酵母菌株，质粒，抗生素，营养培养基，细胞溶解剂；（2）器材：离心机，离心管，烧杯，热水浴，烧杯架，离心瓶，烧杯支架，温度控制器，离心管支架，摇床，培养箱等。

3. 实验步骤（1）菌株提取：将酿酒酵母菌株放入营养培养基中，摇床培养24小时，然后用离心机离心提取菌液；（2）培养基种植：将菌液滴入营养培养基中，放入培养箱培养24小时；（3）抗生素添加：将抗生素添加到营养培养基中，放入培养箱培养24小时；（4）质粒提取：将质粒放入烧杯中，加入细胞溶解剂，热水浴溶解，然后用离心机离心；（5）构建质粒：将质粒和菌液混合，放入烧杯中，加入CaCl2，放入热水浴37℃反应30min，然后用离心机离心；（6）质粒转化：将离心后的质粒液滴入培养基中，放入培养箱培养24小时；（7）抗性检测：将质粒转化后的酵母菌株放入营养培养基中，添加抗生素，放入培养箱培养24小时，观察菌株是否有抗性。

4. 实验结果（1）质粒转化后酵母菌株具有抗性：质粒转化后的酵母菌株在抗生素的作用下仍能够正常生长，表明质粒转化后的酵母菌株具有抗性。

（2）质粒转化效率估算：通过对质粒转化后的酵母菌株的抗性检测，估算出质粒转化的效率为85%。

5. 结论通过本实验，我们可以得出结论：酿酒酵母质粒转化实验成功，质粒转化后的酵母菌株具有抗性，质粒转化效率估算为85%。

酿酒过程中的酵母分离是一个关键步骤，它确保了酿造过程中使用的是纯净且适合特定酒种的酵母菌株。

以下是一些酿酒酵母分离的基本步骤和注意事项：
1. 样品采集：酿酒酵母通常来源于发酵液、酒糟或酵母泥。

采集样品时，应确保工具的无菌操作，避免污染。

2. 分离纯化：将采集的样品进行适当的稀释，然后取一定量涂布于选择性培养基上，如YEPD培养基，这是一种常用的富集培养基。

在适当的温度（通常是28℃）下培养几天，以便酵母生长形成单菌落。

3. 单菌落挑选：在培养基上，挑选出不同的单菌落，这可以通过观察菌落的颜色、形状和质地来初步判断酵母的种类。

4. 形态鉴定：将挑选出的单菌落接种到WL鉴别培养基上，进一步观察和鉴定。

酿酒酵母在WL培养基上通常呈现为奶油色带有绿色、不透明，形状为球形、光滑、突起。

5. 生理生化测试：进行一系列的生理生化测试，以确定酵母的种属。

这些测试包括发酵能力、产生酒精的类型和数量、对不同碳源和氮源的利用等。

6. 分子生物学鉴定：为了更准确地鉴定酵母菌株，可以采用分子生物学方法，如PCR和DNA测序，分析其核糖体RNA（rRNA）或内部转录间隔区（ITS）等基因序列。

7. 保存与应用：经过鉴定和性能测试的酵母菌株可以保存于-4℃的冰箱中，用于未来的酿造。

在实际酿造过程中，根据酵母的特性选择合适的接种量和发酵条件。

在整个分离和纯化过程中，无菌操作是关键，避免任何外来的污染。

此外，记录所有的操作步骤和结果也是非常重要的，以便于后续的跟踪和分析。

在酵母的应用上，还需考虑其对酿造条件的适应性，以及是否能产生期望的风味特征。

酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。

常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。

试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。

2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。

首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。

此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。

3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。

一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。

其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。

在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。

4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。

纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。

在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。

纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。

5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。

- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。

- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。

- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。

- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。

一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
熊福银;林艳丽;吴晓洁;周艳荣;邓继先;陈红星
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2009(20)3
【摘要】目的:建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法.方法:用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒.结果:与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异.结论:建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法.
【总页数】2页(P386-387)
【作者】熊福银;林艳丽;吴晓洁;周艳荣;邓继先;陈红星
【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北
京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.一种快速高效提取酵母质粒的方法 [J], 张怡;刘坤;曹鹏;魏森;韦丹丹;杜建;李鹏坤;李成伟
2.一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法 [J], 何冬兰;余金龙;邵坤彦;邵洁云
3.一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法 [J], 郭旭东;毛舒燕;侯冬霞;旭日干
4.一种简便的适用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法 [J], 苑丽娜;王定和;王永杰;郭佳;单卫星
5.一种从酵母菌转化子中分离、检测重组质粒的有效方法 [J], 刘巍峰;高东
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质粒抽提的8大窍门时间：2010-02-04 09:42:01 来源：作者：点击：480次1、摇菌时间过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。

如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。

2、起始菌体量大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。

3、菌体的彻底悬浮如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。

这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

4、使用相对过量的试剂这是适合所有核酸抽提的建议。

试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。

如果认为这样不经济，就少用一点菌体。

5、裂解时间加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。

体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。

如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。

如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。

6、中和的操作在1.5ml离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。

效果非常好。

7、中和后的离心去蛋白一定要将蛋白质彻底离心下去。

如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。

【降低 RNA 残留的方法】RNA的去除，首先是使用 RNase 消化。

在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA残留，但都不能彻底去除。

幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。

6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。

提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。

以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。

2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。

3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。

4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。

5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。

6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。

7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。

8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。

9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。

10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。

这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。

实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。

酵母抽提物生产流程第一篇：酵母抽提物生产流程酵母提取物前处理和自溶：废酵母→清水洗涤→过滤→酵母泥→加水调至含干酵母10％～15％→调pH至4．5→夹层热保温45℃～55℃→自溶24小时。

自溶期间每隔1小时开动搅拌2～5分钟，搅拌有利于酶类和酵母内大分子物质充分接触，提高单位接触面底物的浓度，从而加快细胞内酶的反应速度。

为了加速细胞的自溶，还可添加2％～3％的氯化钠，其对提高抽提物得率和上清液氨基氮含量有一定促进作用。

酶解：自溶结束后，在自溶酵母液中加入0.2％复合酶，调整物料pH为7．0，在50℃条件下酶解24小时。

酶解结束后，经纳米对撞机在150MP～200MP下进行破碎。

其作用原理是：物料形成150MP以上的高压射流，经分流装置被分成两股，然后，两股高压射流体在一个腔体内发生对撞，产生瞬时高压使振荡片振荡，形成频率高达20000赫兹以上的超声波，酵母细胞在对撞和超声波的强大压力的共同作用下发生纳米级破碎。

经纳米对撞机处理后，用显微镜检测，混合物料中大多数为空腔细胞和大量碎片，酵母细胞壁的破碎率可达97．9％，抽提物得率为91．8％。

破碎液经进一步纯化、浓缩后可制得淡黄色的胶木抽提物制品。

采用上述方法制得的酵母抽提物，肌苷酸（I）含量为1．27g／100g，鸟苷酸（G）含量为1．498g／100g牞（I＋G）为2．76g／100g。

与日本日研公司同类产品相比，指标分别提高294．4％、626．82％、413．96％。

具体工艺：废酵母预处理【120目过筛→脱苦→调整母液浓度(10%~15%)→加促进剂（2%Nacl）→自溶（温度50℃，pH5.2～6.0，24h）】→酶解（0.2%,pH7.0，50℃，24h）→纳米对撞机破碎（150MP～200MP，循环2～4次）→加麦芽根酶解酶（70℃，3～4h）→加热灭酶（95℃，10分钟）→离心分离→酵母上清液浓缩→酵母抽提物产品。

以上所述啤酒酵母抽提物的提取技术，其关键点是将传统的自溶、酶解方法与先进的纳米破碎技术相结合，利用高压撞击作用破碎酵母细胞壁，从而使其内容物最大限度溶出，提高制品中氨基酸含量。