酵母原生质体的制备方法

利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线1. 引言原生质体育种技术是一种用于获得优良酵母菌的重要方法。

本文将探讨如何设计一个实验路线，利用原生质体育种技术获得优良酵母菌。

2. 实验目的本实验的目的是通过原生质体育种技术，获得具有优良性状的酵母菌株。

具体目标包括： - 提高酵母菌的产酒能力 - 提高酵母菌对环境胁迫的适应能力 - 提高酵母菌的耐受性和稳定性3. 实验设计3.1 材料准备•酵母菌菌株：选择适合的酵母菌菌株，如Saccharomyces cerevisiae•培养基：准备适当的培养基，如YPD培养基•原生质体提取试剂盒：选择合适的试剂盒，用于提取酵母菌的原生质体3.2 实验步骤3.2.1 酵母菌培养1.从酵母菌冻存管中取出适量的酵母菌菌株，接种到含有YPD培养基的琼脂糖平板上。

2.在30℃的恒温培养箱中培养酵母菌菌株，直到菌落生长到适当大小。

3.2.2 原生质体提取1.从培养好的酵母菌菌落中，挑取一些菌落放入离心管中。

2.加入适量的原生质体提取试剂盒中的试剂，按照试剂盒说明书的操作步骤进行原生质体提取。

3.2.3 原生质体融合1.准备两个含有原生质体的酵母菌株。

2.将两个酵母菌株的原生质体混合在一起，并进行电融合或化学融合。

3.2.4 原生质体育种1.将融合后的酵母菌菌株接种到含有YPD培养基的琼脂糖平板上。

2.在适当的温度下培养酵母菌菌株，直到菌落生长到适当大小。

3.重复以上步骤，进行多次原生质体育种。

3.2.5 优良酵母菌筛选1.从原生质体育种的酵母菌菌落中，挑取一些菌落放入含有YPD培养基的琼脂糖平板上。

2.在适当的温度下培养酵母菌菌株，观察其生长情况和产酒能力。

3.选择生长良好且产酒能力较高的菌落，进行进一步鉴定和培养。

4. 结果分析通过上述实验步骤，我们可以获得经过原生质体育种的酵母菌菌株。

这些菌株可能具有更好的产酒能力、环境适应能力、耐受性和稳定性。

进一步的鉴定和培养可以确定这些菌株的优良性状，并用于相关应用。

耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究俞志敏;栾静;徐鹏;王继花;赵长新【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2008(000)004【摘要】对1株耐高糖酿酒酵母的原生质体制备和再生条件进行了研究.结果表明,发酵7h后为对数生长中期,适宜原生质体化;L16(5)确定制备原生质体的最佳条件为蜗牛酶浓度(1.0%)、KCI高渗缓冲液(O.7mol/L)、酶解时间(1.5h)、预处理剂(0.1%B-巯基乙醇)和酶解温度(26℃),在此条件下原生质体形成率和再生率分别为80.84%和36.03%;原生质体形成后在7%蔗糖高渗培养基上夹层培养再生率较高(39.78%).【总页数】4页(P45-48)【作者】俞志敏;栾静;徐鹏;王继花;赵长新【作者单位】大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034【正文语种】中文【中图分类】TS261.1;T0925;TS262.2【相关文献】1.酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究 [J], 包伟霞;王静洁;王晓斐;陈由强;许旭萍2.酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备与再生的条件优化 [J], 高年发;张颖3.安琪酿酒酵母与管囊酵母原生质体制备和再生 [J], 郑州;田辉;程金花;赵儒铭;李志军;姚娟;龚大春4.安琪超级酿酒酵母原生质体制备与再生条件研究 [J], 赵悦茗;杜跃超;罗晨5.酿酒酵母W5原生质体制备及再生条件的初步研究 [J], 孙红兵;宋刚;平文祥;葛菁萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种酵母原生质体的制备方法
酵母原生质体是指从酵母细胞内部提取出来的膜包裹的细胞质部分，它是细胞质膜结构和功能的重要载体，可以用于进行酵母细胞的功能研究和酵母基因工程。

酵母原生质体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1.酵母培养
首先，选择合适的酵母菌株进行培养，培养条件包括适宜的培养基、温度和营养条件。

常见的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和模式酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。

2.酵母细胞收获
当酵母菌培养到合适的生长阶段时，可以通过离心的方法将酵母细胞从培养液中分离出来。

离心一般使用低速(1000g)离心5-10分钟，沉淀下的酵母细胞就是我们需要的起始材料。

3.细胞破碎
将收获的酵母细胞重悬于适量的缓冲液中，如Tris-HCl缓冲液。

加入几滴苯甲酸醛溶液，使酵母细胞变性，同时加入玻璃珠或砂石进行机械破碎。

破碎条件可以根据不同的酵母菌株进行优化，一般破碎时间为5-15分钟。

4.细胞裂解
5.膜分离
将第二次离心得到的沉淀进行再次重悬于适量的缓冲液中，加入适量的D-葡萄糖和抗生素等，使其在37摄氏度下进行孵育。

由于酵母细胞的膜是整个原生质体的重要组成部分，通过孵育使得母细胞膜融合，形成完整的原生质体。

孵育时间一般为30-60分钟。

6.原生质体提取
需要注意的是，上述制备方法中的条件和步骤可以根据不同的实验目的进行优化和调整。

此外，酵母原生质体的制备是一个相对复杂的过程，对实验技术要求较高，需要注意避免样品污染和抗体交叉反应等问题。

酵母原生质体融合生态学院生物11 20号李香酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。

酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。

酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。

其繁殖的方法为出芽生殖。

酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因而对菌种的选育和改良显得尤为重要。

原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。

原生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。

从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程[1]。

目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。

本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。

望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得较高的经济效益。

1材料1.1样品菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。

1.2 培养基和试剂(1)马铃薯培养基：马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖20g，水1000 mL。

配制方法下：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分1000 Ml,自然pH。

(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸馏水1000 mL，pH6.0。

(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD)：在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl，3％琼脂。

1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。

培养物在预称重的离心瓶中于4℃，1 500g 离心5 min。

2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。

在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。

3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。

4. 于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。

5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。

6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。

7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。

8. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min回收原生质体。

9. 用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。

10. 在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。

11. 往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。

于4℃在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管15~30 min。

12. 于4℃，45Ti 转子上100 000 g 离心90 min。

收集上清，在100体积贮存缓冲液中透析2~4 h。

将透析袋转移到100体积新鲜的贮存缓冲液中，再透析2~4 h。

13. 取出几微升透析液，用水作1 ：1 000稀释，测定电导率。

第一章绪论一、填空题1．世界上第一个看见并描述微生物的人是荷兰商人安东•列文虎克，他的最大贡献不在商界，而是利用自制的____显微镜___发现了微生物世界。

2．微生物学发展的奠基者是法国的巴斯德，他对微生物学的建立和发展作出卓越的贡献，主要集中体现__彻底否定了“自生说”学说___、__免疫学——预防接种__和__证实发酵是由微生物引起的___；而被称为细菌学奠基者是_德__国的_____柯赫____，他也对微生物学建立和发展作出卓越贡献，主要集中体现____建立了细菌纯培养技术___和__提出了柯赫法则____。

3．微生物学发展史可分为5期，其分别为史前期、初创期、___奠基期____、______发展期和成熟期；我国人民在史前期期曾有过重大贡献，其为制曲酿酒技术。

4．微生物学与___数___、___理____、___化___、信息科学和技术科学进一步交叉、渗透和融合，至今已分化出一系列基础性学科和应用性学科，如化学微生物学、分析微生物学、生物生物工程学、微生物化学分类学和微生物信息学等。

5．微生物的五大共性是指体积小，面积大、吸收多，转化快、生长旺，繁殖快、适应性强，易变异、分布广、种类多。

二、问答题：1．“微生物对人类的重要性，你怎么强调都不过分。

”试用具体事例来说明这句话的深刻意义。

(从四个方面具体的事例来说明人类与微生物的关系。

)(1) 物质和能量循环(2)人体生理屏障(3)提供必需物质(4)现代生物技术等方面。

2．简述科赫原则。

(如何判定某种微生物是病原菌？)3．微生物有哪五大共性？其中最基本的是哪一个？为什么？4．什么是微生物，微生物学？学习微生物学的任务是什么？5．简述微生物对生命科学基础理论研究有何重大贡献？答案要点：1）微生物是生命科学研究的理想材料；2）利用酵母菌细胞制剂进行酒精发酵研究，不但阐明了生物体内糖的复杂转化过程，且为近代生物化学领域的酶学奠定了基础；3）比德尔（Beadle）用脉胞菌进行突变试验，阐明了基因和酶的关系，提出了“一个基因一个酶”的假说，开创了生化遗传学新学科；4）遗传的物质基础是用微生物证实的；5）遗传密码的被揭露、中心法则的确定、基因对酶的调节控制在分子生物学的基本原理都与微生物学有密切关系；6）遗传工程的主角：①作为遗传工程中表达DNA所携带的遗传性状的载体，今天依然以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌等微生物为主，基因工程药物的生产几乎都是微生物；②在基因工程的操作中用于切割DNA取得所需基因的“手术刀”的限制性内切酶都来自微生物；③基因的载体是病毒、噬菌体、质粒；④动植物细胞培养和发酵技术；7）微生物技术向微生物科学的整个领域扩散。

真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。

B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。

也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。

（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。

微生物学习题库与答案一、单选题（共60题，每题1分，共60分）1、E. coli在一般液体培养时，细胞浓度可达（）。

A、2×10^10B、2×10^7C、2×10^8D、2×10^9正确答案：D2、筛选营养缺陷型时，为了达到淘汰野生型目的，可将诱变后的细菌培养在含青霉素的（）。

A、限量补充培养基B、补充培养基C、完全培养基D、基本培养基正确答案：D3、污水处理中的生化曝气法是一种（）。

A、生物吸附法B、生物膜法C、活性污泥法D、生物降解法正确答案：C4、在杆状细菌中，假单胞菌以长有（）出名。

A、周生鞭毛B、两端生鞭毛C、侧生鞭毛D、一端生鞭毛正确答案：D5、细菌的呼吸链在( )上。

A、质粒B、细胞壁C、线粒体D、细胞膜正确答案：D6、在金黄色葡萄球菌菌肽聚糖中，四肽尾的结构是（）。

A、L-Ala→D-Glu→L-Lys→L-AlaB、L-Ala→D-Glu→m-DAP→D-AlaC、D-Ala→L-Glu→D-Lys→L-AlaD、L-Ala→D-Glu→L-Lys→D-Ala正确答案：D7、在芽孢的各层结构中，含DPA-Ca量最高的层次是( )。

A、胞外壁B、芽孢衣C、皮层D、芽孢核心正确答案：C8、代时是指（）。

A、细胞分裂繁殖一代所需要的时间B、从对数期结束到稳定期开始的间隔时间C、培养物从接种到开始生长所需要的时间D、培养物的生长时间正确答案：A9、为治疗由于正常菌群失调而引起的腹泻症，常宜应用（）。

A、针对G－菌的抗生素B、广谱抗生素C、一段时间内饥饿D、口服某些活微生物制剂正确答案：D10、制备酵母菌的原生质体可用（）处理。

A、蜗牛消化酶B、几丁质酶C、纤维素酶D、溶酶菌正确答案：A11、在四条产能代谢途径中，有3条途径存在底物水平磷酸化产ATP，它们是（）。

A、EMP、HMP及TCAB、EMP、HMP及EDC、HMP、ED及TCAD、EMP、ED及TCA正确答案：D12、V.P试验的依据来自（）。

菌落PCR法
利用PCR分析酵母菌落
1.在一个无菌的0.5ml微量离心管里，依次再加入下列物质：
10×菌落PCR缓冲液2μl
25mmol/L MgCl2 1.2μl
10mmol/L dNTPs 0.4μl
寡核苷酸引物每个引物浓度为10 pmol
Taq聚合酶5单位（0.2μl）
H2O加至总体系为20μl
2.用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落（0.1-0.25μl），加入反应体
系。

取酵母菌落时切不可过多。

因为细胞壁的成分可抑制PCR反应。

3.将PCR管放进PCR仪内。

进行PCR反应。

4.用琼脂凝胶电泳分析PCR产物。

如果目的序列的扩增条带微弱或者杂乱，将链延伸温度比按AT含量丰富的那条寡核苷酸引物的T m计算值降低2~3℃，重新PCR。

如果PCR结果仍然不十分满意，可在PCR前用酶解酶100T除去细胞壁，使酵母细胞成为原生质体，此步骤仅需1h，通常可以解决问题。

另一种方法是，将待测菌落在10mlYPD培养基中培养，制备少量的酵母DNA用于扩增。