下载文档原格式
复合诱变和原生质体融合选育S-腺苷甲硫氨酸酿酒酵母高
产菌株的开题报告
一、选题背景
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）在酿酒过程中具有重要的作用，可以促进酵母细胞的生长和发酵效率。
因此，高产SAM的酿酒酵母菌株一直是酿酒行业关注的研究方向之一。
目前，一些研究者通过单一菌株的选育和基因工程技术来提高酿酒酵母的SAM产量和酿酒性能，但效果并不理想。
因此，采用复合诱变和原生质体融合技术选育SAM高产酵母菌株，是一种新的思路和方法。
二、选题意义
选育SAM高产酵母菌株，不仅可以提高酿酒的加工效率和经济效益，还可以减
少对外界添加SAM的依赖，从而降低酿酒成本。
此外，该研究还将为酿酒酵母的选育和基因工程技术的进一步发展提供新的参考和思路。
三、研究内容和方法
本研究的主要研究内容为利用复合诱变和原生质体融合技术选育SAM高产酵母
菌株。
其中，复合诱变是通过同时利用物理、化学和生物等多种方法诱发酵母基因突变，从而选择SAM高产菌株。
原生质体融合是将两个不同的酿酒酵母菌株的原生质体通过化学和电融合的方法融合在一起，从而实现SAM合成途径上的基因重组和优化。
四、预期成果
本研究预期通过复合诱变和原生质体融合技术，筛选出SAM高产菌株，并对其
基因组进行分析和比较，从而确定SAM增加的可能机理和途径。
该研究将为酿酒酵母的选育和基因工程技术的进一步发展提供新的参考和思路。
高产虾青素的红法夫酵母菌株选育研究进展
孙克诚;胡丹丹;袁文华;王令;周静静;王梓旭
【期刊名称】《中国畜牧杂志》
【年(卷),期】2024(60)5
【摘要】虾青素(3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素)具有极强的抗氧化活性,还具有抗炎、抗凋亡、抗癌等多种生理功能。
天然虾青素因其生物活性、利用率和安全性高于化学合成虾青素,更受消费者青睐。
红法夫酵母能利用多种碳源且培养周期短,是理想的天然虾青素来源,但因生产中虾青素产量较低限制了红法夫酵母在工业上的应用。
本文从育种、优化培养基及改造合成途径等方面综述了提高红法夫酵母虾青素产量的主要方法,以期为提高虾青素产量及红法夫酵母在工业生产上的应用提供理论依据。
【总页数】6页(P12-17)
【作者】孙克诚;胡丹丹;袁文华;王令;周静静;王梓旭
【作者单位】安佑生物科技集团股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】S816
【相关文献】
1.复合诱变选育高产虾青素的红法夫酵母菌株
2.法夫红酵母高产虾青素菌株的研究进展
3.利用亚硝酸钠选育法夫酵母虾青素高产菌株
4.红法夫酵母高产虾青素菌株的选育
5.法夫酵母诱变选育高产虾青素菌株的研究
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生物技术虾青素（astaxanthin），是一种类胡萝卜素，化学名称为3，3′－二羟基－4，4′－二酮基－β，β′－胡萝卜素，又名虾黄素，虾黄质或龙虾壳色素。
天然虾青素于自然界广泛的存在，尤其是在海洋环境中。
大量研究证明，虾青素具有增强免疫力；抗衰老；降低心血管疾病和由化学因素诱发的癌症发病率；增加对有害生物的抵抗力；维护眼睛和中枢神经健康；抗氧化能力极强，增强肌肉力量和耐受力等重要的生理功能，而且对人体绝对安全。
因此，虾青素在食品工业、饲料工业、化妆品工业、保健品和医药工业等方面具有广阔的应用前景[1-2]。
本论文以CTD004为出发菌株，对其进行超声波诱变，提高了该菌生产虾青素的能力，采用这种传统的生物物理学方法，不但生产出的产品安全无毒副作用，而且可以提高虾青素产量。
１ 材料与方法１．１ 材料与试剂1.1.1 菌株 CTD004菌株（自命名，经初步鉴定属于假单胞菌属）：吉林农业大学发酵工程实验室。
1.1.2 培养基及试剂1.1.2.1 基础培养基 蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，酵母膏2.0 g，定容至1 L蒸馏水中，pH 7.2～7.5，121℃，灭菌20 min。
1.1.2.2 发酵培养基 蛋白胨10.0 g，可溶性淀粉10.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，酵母膏2.0 g，定容至1 L蒸馏水中，pH 7.2～7.5，121℃，灭菌20 min。
虾青素标准样品（购于Sigma公司），二甲基亚砜、氯仿、甲醇、冰醋酸、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O均为进口分装或国产分析纯。
１．２ 方法1.2.1 菌种超声波驯化和筛选 1.2.1.1 菌悬浮液的制备 将出发菌株接种于固体培养基上，32℃培养16 h（种龄处于对数期），用接种环移一个虾青素菌落至无菌试管中（9 mL装有玻璃珠的生理盐水），振荡10 min 过滤，即得菌体悬浮液。
运用紫外线灭活原生质体融合技术选育高产酯酒精酵母的研究赵华;赵树欣
【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】1996(000)005
【摘要】本文运用紫外线灭活原生质体融合技术，在对酒精酵母（Ｋ酵母）和产酯酵母（Ｆ２）的原生质体形成率及紫外线灭活条件进行研究的同时，通过筛选不影响亲株代谢性能的天然耐药性为遗传标记，简化融合子检出步骤，成功地对酒精酵母和产酯酵母进行了属间细胞融合，获是６株遗传性状稳定的融合子。
经发酵实验，最终获得既具有酒精酵母的高产酒特性，又具有产酯酵母的高产酯特民生的发酵性能稳定的融合子ＦＫ３－２７。
【总页数】4页(P13-16)
【作者】赵华;赵树欣
【作者单位】天津轻工业学院食品系白酒实验室;天津轻工业学院食品系白酒实验室
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.11
【相关文献】
1.双亲灭活原生质体融合选育高性能酒精酵母菌的研究 [J], 易弋;黎娅;程谦伟;龚熠;黄翠姬;伍时华
2.用原生质体融合技术选育2—酮基—L—古龙酸高产菌株的研究 [J], 吕群燕;王
书棉
3.双灭活原生质体融合法选育耐高温高产酒精酵母的研究 [J], 杨汝德;朱文生
4.原生质体融合技术选育赖氨酸高产株的研究Ⅱ.原生质体融合试验及融合株选育[J], 周婉冰;云逢霖
5.原生质体融合技术选育赖氨酸高产菌株的研究Ⅰ.原生质体形成与再生条件的研究 [J], 周婉冰;周惠;云逢霖
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高产虾青素的红发夫酵母菌株进化工程研究的开题报告一、研究背景和意义虾青素是一种天然的色素，属于类胡萝卜素，并且具有很高的生理活性。
在医学、保健品、美容美发、化妆品等领域有广泛的应用。
目前，虾青素主要来源于虾、龙虾等海洋生物或合成。
其中合成方法的成本相对较高，且存在部分半合成过程，导致纯度和产量无法完全满足市场需求。
相比之下，从天然来源中提取虾青素的方法生产成本较低，但是其受到时间、环境的限制，产量不可控。
红发夫酵母菌属于一种产生类胡萝卜素的微生物，可以在发酵过程中产生大量的虾青素。
其在发酵过程中的高产静态水平、灵敏性广、培养条件简单、无需繁琐操作，因此被广泛地研究。
通过进化改良可以提高微生物的虾青素生产能力，因此，对红发夫酵母菌株的进化改良研究有着重要的意义。
本研究旨在利用红发夫酵母菌株进行虾青素的高产，探究其进化改良的途径，以期能够获得更高的虾青素产量。
二、研究内容和方法1. 红发夫酵母菌株的筛选：从自然环境中分离出不同来源的红发夫酵母菌株，对其进行初步的鉴定和对比试验，并选择其中虾青素产量较高的菌株作为后续研究对象。
2. 进化改良方法的建立：通过体外化学诱变技术和自然筛选技术建立进化改良体系。
在此基础上，对产量较高的红发夫酵母菌株进行细胞物质组分分析，进一步明确其关键代谢途径及调控机制。
3. 进化改良的实验设计：通过在不同培养条件（如温度、pH值、碳源、氮源等）下，定期对红发夫酵母菌株进行连续发酵和间歇发酵的实验，对虾青素产量进行监测，以寻找最适合产量的培养条件。
4. 虾青素的提取和分离：对红发夫酵母菌株进行优选，并分离取得纯度较高的虾青素，通过超高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、红外线光谱仪等对虾青素进行鉴定和定量。
三、研究预期结果通过对红发夫酵母菌株进行进化改良，筛选出高产虾青素的菌株，并优化培养条件，进一步提高虾青素产量，达到较高程度的工业化生产。
本研究对虾青素的生产与应用领域具有重要的研究价值和应用价值。
红发夫酵母产虾青素研究进展红发夫酵母产虾青素研究进展朱明军林炜铁吴海珍吴振强梁世中(华南理工大学食品与生物工程学院,广州,510640)摘要虾青素是一种极具潜力的色素和抗氧化剂,在水产养殖、饲料、食品和医药工业具有应用前景。
本文对虾青素的生物来源,产虾青素红发夫酵母菌株的筛选,培养基的优化以及虾青素的提取等进行了论述。
关键词虾青素红发夫酵母类胡萝卜素虾青素,3,3 二羟基 4,4 二酮基 , 胡萝卜素,是一种非维生素A原的类胡萝卜素,在动物体内不能转变为维生素A,但它有极强的抗氧化性能。
动物试验表明它有抑制肿瘤发生,增强免疫功能等多方面的生物学功能,因此在功能食品和医药方面有广泛的应用前景[1]。
同时虾青素又是一种良好的着色剂,是鲑鱼等鱼类的主要色素,而动物缺乏合成类胡萝卜素的能力,因此虾青素在水产养殖方面具有重要价值,有1亿美元市场[16]。
虾青素的主要生物来源是甲壳类动物和提取液、水球藻和红发夫酵母(Pha ffia rhodo zyma)。
甲壳类动物虾青素含量低,不适合作为虾青素的大规模来源;水球藻虾青素含量高,达到0.2%~2%,但水球藻自养培养周期长,需破壁释放虾青素,因此进行大规模生产也比较困难;红发夫酵母具有作为色素生物来源的一些必要的特征:快速异养代谢,培养时间短,能够在发酵罐中实现高密度培养等。
但是野生型红发夫酵母虾青素含量还不够高,只有200~300 g/g干细胞,与工业生产还有一定的差距。
因此,这3种生物来源目前均缺乏与合成添加剂竞争的能力[17]。
在上面3种生物来源中,红发夫酵母具有生长速度快,发酵周期短,以及色素提取后菌体单细胞蛋白可作为饵料、饲料添加剂等优点而成为目前研究的重点。
红发夫酵母属于担子菌纲(Basid iomycetes)的红发夫酵母属。
这种酵母菌最早由Phaff等人在美国阿拉斯加的高山上和日本国采集到,后经Miller鉴定并命名为新属红发夫酵母属种,1976年Andrews等发现其产生虾青素[2]。
原生质体融合技术筛选高产虾青素酵母菌株刘虹;程秀芳;张志焱;谷巍【摘要】采用原生质体融合技术,以红发夫酵母突变株和黏红酵母突变株为亲本菌株,以原生质体形成率和再生率的乘积为检测指标,对菌株菌龄、酶解温度、酶解时间和渗透压稳定剂等原生质体形成和再生的条件进行研究.结果表明,处于对数生长前期的红发夫酵母和处于对数生长中期的黏红酵母原生质体形成率和再生率的乘积显著高于其他组(P＜0.05);红发夫酵母原生质体形成率和再生率的乘积在酶解温度22℃时为17.34％,在25和28℃时为0,黏红酵母形成率和再生率的乘积在22和25℃时显著高于28℃(P＜0.05),但2个温度之间差异不显著(P＞0.05);2菌株原生质体形成率和再生率的乘积在酶解时间为2h时显著高于其他组(P＜0.05);对照组渗透压稳定剂的组合对原生质体形成率和再生率的乘积显著高于其他组(P＜0.05).红发夫酵母和黏红酵母原生质体形成和再生的最适条件为:红发夫酵母菌龄为14 h、黏红酵母菌龄为18h、酶解温度均为22℃、酶解时间均为2h,原生质体形成的最适渗透压稳定剂均为1.0 mol/L的KCl缓冲液,再生的最适渗透压稳定剂均为17％蔗糖稀释液;最后筛选出1株能在28℃生长良好且虾青素含量586.38 μg/g的融合子,比融合前红发夫酵母和黏红酵母分别提高了79.58％和64.08％,且传代多次生产性能稳定.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)010【总页数】6页(P156-161)【关键词】红发夫酵母;黏红酵母;原生质体;蜗牛酶;溶菌酶【作者】刘虹;程秀芳;张志焱;谷巍【作者单位】山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000【正文语种】中文【中图分类】Q242虾青素全称为3，3′－二羟基－4，4′二酮－β，β′－胡萝卜素，是一种非维生素A原含氧类胡萝卜素，在动物体内不能转化为维生素A，但它是一种不断链抗氧化剂，可高效的淬灭单线态氧和清除自由基，因而虾青素享有“超级维生素E”的美誉（Miki，1991）。
目前已被广泛应用于饲料、食品、医药、化妆品和保健品的生产，国际市场需求量较大，应用前景非常广阔。
Phaff等（1972）在美国的阿拉斯加和日本的高纬度地区首先分离到红发夫酵母（Phaffia rhodozyma）。
Andrewes等（1976）发现该菌能产生虾青素；Johnson（1980）把发酵培养菌体应用于鱼和鲟鱼的饵料中，获得了良好的养殖效果。
红发夫酵母在其所产类胡萝卜素中，虾青素所占比例为60%～85%，但由于虾青素是胞内色素，是一种与细胞生长相偶联的次级代谢产物，且红发夫酵母最适生长温度低，菌体生长缓慢，所以虾青素的产量也比较低。
目前高产虾青素酵母菌株主要是通过反复多次诱变和筛选（田小群等，2003），但反复多次诱变会有许多对生产发酵有毒的突变，且会产生抗药性，难以再大幅度提高产量（Chun等，1992）。
原生质体融合（protoplast fusion）可发生在种内、种间，甚至亲缘关系很远的2个物种之间，可以扩大融合频率和幅度，是一种常见的育种方法，具体是用水解酶去除细胞壁，释放出只有原生质膜包被的球状原生质体，然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。
由于原生质体融合能显著提高重组频率及进行定向育种，因此该技术被广泛应用于细胞育种。
本试验利用原生质体融合技术，用蜗牛酶和溶菌酶使红发夫酵母和黏红酵母细胞破壁，并对影响原生质体形成和再生的几个因素做了探讨，使原生质体的形成率和再生率达到一个较高的水平，为以后以酵母原生质体为媒介的育种和融合技术提供较好的试验系统，以期获得1株遗传稳定性好、高产虾青素的融合菌株。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株红发夫酵母突变株和黏红酵母突变株均由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心保存。
1.1.2 培养基 YPD液体培养基：葡萄糖10g、酵母浸膏3g、麦芽汁3g、蛋白胨5g、水1000mL；固体培养基A：液体培养基上加琼脂20g；固体培养基B：将固体培养基A中的葡萄糖改为50g；发酵培养基：葡萄糖20g、酵母膏10g、（NH4）2SO45g、KH2 PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2·2H2O 0.1g、水1000mL，初始 pH 6.0；再生完全培养基：YPDK、YPDC和YPDT高渗固体培养基配方分别在YPD固体培养基B基础上加1.0mol／L KCl、0.8mol／L甘露醇和17%蔗糖。
1.1.3 试剂 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，121℃灭菌20min。
高渗缓冲液：PCK、PCT和PCC液分别为用0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液配制的1.0mol／L KCl、17%蔗糖和0.8mol／L山梨醇，121 ℃ 灭菌 20min。
预处理剂（现配）：0.05mol／L EDTA、0.5mol／Lβ－巯基乙醇，均用高渗缓冲液配制。
酶液：蜗牛酶和溶菌酶均购自北京欣经科技生物技术有限公司。
PCK酶液、PCT酶液和PCC酶液分别用PCK液、PCT液和PCC液配制的1.0mg／mL蜗牛酶和0.5mg／mL溶菌酶，酶液需现配，配好后经0.22μm微孔滤膜过滤。
原生质体稳定液（SMM，现配）：0.5mol／L 蔗糖、0.02mol／L MgCl2、0.02mol／L 顺丁烯二酸，pH 6.5，121℃灭菌20min。
促溶剂（现配）：40%PEG（W6000）的SMM溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
1.2 方法1.2.1 菌龄对原生质体形成与再生的影响取生长期3个阶段的2株菌菌液制备原生质体，酶系统中酶总浓度为1.5%，高渗缓冲液为PCK液，酶液由PCK液配制，酶解时间为1h，酶解温度为22℃。
1.2.2 酶解温度对原生质体形成与再生的影响选择22、25和28℃3个酶解温度，酶系统其他条件同1.2.1。
1.2.3 酶解时间对原生质体形成与再生的影响在最适菌龄及酶解温度下，选择1、1.5和2h3个酶解时间，酶系统中其他条件同1.2.1。
1.2.4 渗透压稳定剂对原生质体形成与再生的影响在最适菌龄、酶解温度及酶解时间条件下，选用1.0mol／L KCl、0.8mol／L 山梨醇和17%蔗糖为渗透压稳定剂，配制混合酶液、稀释液及再生培养基，同时以 PCK 酶液－1.0mol／L蔗糖稀释液－YPDK再生培养基组合为对照，酶系统中其他条件同1.2.1。
1.2.5 菌体的培养红发夫酵母的培养：将斜面种子转接种子培养基，温度22℃，转速180r／min培养24h，再按10%（V∶V）接种量接入发酵培养基培养72h。
黏红酵母的培养：将斜面种子转接种子培养基，28℃、150r／min培养24h，10%接种到二级种子培养基培养12h，再将二级种子以10%（V∶V）的接种量发酵培养基，28℃、150r／min培养72h。
2菌株生长曲线发酵培养基是YPD液体培养基，融合菌株发酵培养基为1.1.2的发酵培养基。
1.2.6 生长曲线的测定采用细胞干重法（诸葛健等，1994）测定生长曲线。
1.2.7 原生质体的制备、再生与剩余菌数的测定取培养好的菌液2mL，3500r／min离心5min收集菌体，2mL磷酸缓冲液洗涤1次，再用高渗缓冲液洗涤1次，将菌体悬浮于2mL高渗缓冲液中，振荡均匀；取0.2mL样品，用生理盐水稀释，取相应梯度的稀释液涂布在完全培养基平板上，培养48h后进行菌落计数，再取2mL菌液于无菌小试管中，3500r／min离心10min，弃上清收集菌体，加入5mL 0.05mol／L EDTA、0.4mL 0.5mol／Lβ－巯基乙醇，28℃预处理10min，离心并用高渗缓冲液洗脱2次，再加入2mL含2mg蜗牛酶和1mg溶菌酶的高渗缓冲液，28℃、130r／min振荡保温，每30min取样镜检1次，至80%细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成，离心，去除酶液，高渗缓冲液洗涤2次得原生质体，再将原生质体悬液稀释到约1×102个／mL。
取100μL原生质体悬液到再生培养基平板上涂布，22℃培养3d，计算原生质体形成率和再生率（王殿夫等，2002）。
形成率和再生率的计算采用平皿菌落计算的方法（曲秋皓等，1998）。
公式为：式中，A为酶处理前的活菌计数，B为酶处理后未脱壁的活菌计数，C为酶处理后未脱壁的活菌数与原生质体再生菌落数之和。
1.2.8 原生质体再生后的筛选用接种针挑取原生质体融合后长出的菌落，转接到发酵培养基，28℃、180r／min培养3d，测定生物量、虾青素含量和虾青素产量，并计算虾青素产量的提高率。
1.2.9 融合菌株产虾青素稳定性试验把筛选出产量高的菌株在固体培养基B上进行10次传代培养，再进行发酵培养，测定生物量、虾青素含量和虾青素产量，方法同1.2.8。
1.2.10 虾青素提取及其含量的测定参考许培雅等（2001）方法进行。
1.2.11 数据分析试验数据用平均值±标准差表示，采用统计软件SPSS 13.0中One－Way ANONA进行单因素方差分析，平均值的多重比较采用Duncan氏多重比较检验，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析2.1 菌龄对原生质体形成与再生的影响以时间为横坐标，细胞干重为纵坐标，绘制红发夫酵母和黏红酵母的生长曲线。
红发夫酵母在经过12h的延迟期后，进入对数生长前期，至36h对数生长期基本结束，开始向稳定期过渡，48h菌体生物量达到最大值，48h后随着培养时间的延长，生物量有所下降。
黏红酵母在培养10h后进入对数生长早期，到30h后对数生长期基本结束，进入平衡期。
分别吸取红发夫酵母和黏红酵母生长期3个阶段的菌液制备原生质体，结果见表1。
由表1可知，不同菌株、不同生长阶段菌体对酶液的敏感程度有很大差异。
红发夫酵母原生质体的形成率及形成率和再生率的乘积高低顺序为：对数生长前期＞对数生长中期＞稳定期，再生率高低顺序为：对数生长中期＞对数生长前期＞稳定期；黏红酵母原生质体再生率及形成率和再生率的乘积高低顺序为：对数生长中期＞对数生长前期＞稳定期，形成率高低顺序为：对数生长前期＞对数生长中期＞稳定期。
综合形成率和再生率2方面的因素，以下试验红发夫酵母采用处于对数生长前期的菌体，最适菌龄为14h；黏红酵母采用处于对数生长中期的菌体，最适菌龄为18h。
