氨培养胎鼠神经细胞钙离子浓度变化与凋亡的相关性

弥漫性轴索损伤后内质网钙释放对轴突内早期钙离子浓度的影响李宇;宋锦宁;张明;安吉洋;孙鹏;李丹东;马旭东;赵雅慧【摘要】目的研究弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAD后内质网(endoplasmic reticulum,ER)钙释放的变化,以及对轴突内早期钙离子浓度的影响,并探讨造成ER钙释放的可能分子机制.方法使用体外培养7～12d的小鼠神经元行轴突牵拉损伤建立体外DAI模型,根据是否行牵拉损伤分为损伤组及对照组.使用ER Tracker Red标记ER,观察ER在轴突损伤前后的分布.通过Fluo-4 AM钙探针及激光共聚焦钙成像技术测量单个轴突内钙离子浓度的变化,并使用20 mmol/L咖啡因作用于细胞,使ER内钙离子快速排空,测量轴突部位咖啡因作用前后的钙离子浓度变化,从而间接观察ER内钙存量的变化.结果 ER Tracker Red荧光结果显示ER存在于神经元轴突部位中,损伤后的轴突肿胀部位存在ER聚集的现象.神经元牵拉损伤后,被牵拉的轴突钙离子浓度明显升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),受损的轴突表现出肿胀及“串珠样”变性等病理学改变.除损伤后2 min外,使用无钙细胞外液虽然明显降低了牵拉损伤导致的轴突的钙离子浓度升高,但在2～～30 min时间段中钙离子浓度升高依然存在,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组中未经牵拉损伤的神经元轴突可被20 mmol/L咖啡因激起一个明显的轴突钙离子浓度升高,而牵拉损伤后的轴突对咖啡因的这种钙升高反应程度明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DAI后的轴突钙离子浓度升高不仅由细胞外钙内流引起,细胞内钙释放同样参与其中.ER是引起这种DAI 后轴突内钙释放的细胞器来源.【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(035)006【总页数】7页(P726-732)【关键词】脑外伤;弥漫性轴索损伤;钙;内质网【作者】李宇;宋锦宁;张明;安吉洋;孙鹏;李丹东;马旭东;赵雅慧【作者单位】西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061【正文语种】中文【中图分类】R651.1+5弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)是脑外伤(traumatic brain injury, TBI)的一种重要的病理形式，也被认为是一种特殊的TBI损伤类型[1-2]。

细胞外Ca2+浓度对坐骨神经——腓肠肌收缩的影响schdreamfly【摘要】：目的本实验探讨了不同浓度Ca2+对坐骨神经-腓肠肌收缩的影响，同时进一步探讨了钙离子对坐骨神经-腓肠肌收缩的影响是否具有持久性方法把剥离的坐骨神经——腓肠肌标本分别用任氏液0g/L、0.12g /L（对照浓度）、1.2g /L、12g /L的任氏液浸润, 测定不同Ca2+浓度下肌肉收缩的阈刺激强度和最适刺激强度等生理指标。

测定后将标本返回标准任氏液后5min，再进行各项参数的测定。

结果低于标准浓度的Ca2+可以使标本兴奋性升高，阈值降低，最适刺激强度降低,最适刺激强度下的收缩幅度升高。

高于标准浓度的Ca2+可以使标本兴奋性降低，阈值升高，最适刺激强度升高,最适刺激强度下的收缩幅度降低。

结论【关键词】：Ca2+ 蟾蜍离体坐骨神经——腓肠肌前言Ca2+是人体必需的常量元素，也是构成人体骨骼的最基本原料。

体液含钙量少，但起的作用却很大。

改的其中一个作用就是抑制神经肌肉的过度兴奋性。

血钙浓度降低到7mg/100mL血以下时，神经骨骼肌兴奋性增加，可以出现手足惊厥。

Ca2+是兴奋——收缩的藕联因子,其作用是正性的。

但这是指在兴奋发生之后;对于因快钠通道开放引起的钠离子内流而产生去极化为主的快反应细胞来说,钙离子由于“膜屏障作用”(即对钠离子内流产生竞争性抑制)的存在,细胞外高钙使钠离子内流受到抑制,细胞兴奋性有所下降。

所以,认为钙离子是细胞兴奋抑制离子。

当细胞外低钙时,钙离子的“膜屏障作用”减弱,细胞兴奋性增高。

1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物三只体型大小相似的蟾蜍1.1.2实验器材常用手术器械，RM6240生理信号记录仪，张力传感器，硅板，培养皿，纱布，小烧杯，胶头滴管，移液管，粗棉线，任氏液配方等。

1.1.3实验试剂不同Ca2+浓度任氏液1.2方法1.2.1任氏液浓度的配制把Ca2+加入到标准任氏液中配置成Ca2+浓度为0 g/L、1.2 g/L、12 g/L 的Ca2+——任氏液。

麻醉是使用药物或其他方法使患者整体或局部暂时失去感觉，以达到无痛目的，为手术和其他治疗创造条件的一种方法。

麻醉药物对于中枢神经系统具有一定的保护作用，如对缺血再灌注（isch⁃emia-reperfusion，IR）损伤、创伤性脑损伤、脑卒中、蛛网膜下腔出血、神经外科手术期间脑的保护[1-2]。

但也具有一定的大脑毒性和损伤作用，包括抑制和破坏婴幼儿、小儿神经系统发育，导致记忆、学习功能障碍，致使老年患者发生术后谵妄乃至长期的认知功能障碍等[3-4]。

因此，确切阐明麻醉药物对中枢神经系统的保护作用和毒性，将为临床麻醉药物的选择提供参考，本文就此综述如下。

1麻醉药物的分子靶点1.1化学门控离子通道化学门控离子通道可分为胆碱类、胺类、氨基酸类等。

麻醉药物主要作用于氨基酸类受体发挥作用。

大多数的麻醉药物都可抑制N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体，和兴奋γ-氨基丁酸A型（gamma absorptiometry aminobutyricacid，GABAA）受体。

1.1.1NMDA受体NMDA受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型，它由NR1和NR2（2A、2B、2C和2D）亚基组成[5]。

氯胺麻醉药物的神经保护作用与神经毒性研究进展胡雨蛟1，吴安国2，欧册华3（西南医科大学：1麻醉系；2中药活性筛选及成药性评价泸州市重点实验室；3附属医院疼痛科，四川泸州646000)摘要麻醉药物具有神经保护作用，同时也有一定的神经毒性，如何实现其神经保护作用，减少神经毒性，成为临床麻醉医生面临的重要难题。

本文从麻醉药物的作用分子靶点、神经保护作用、神经毒性以及如何减轻神经毒性等方面进行了综述，以期为临床麻醉用药选择提供参考。

关键词麻醉药物；神经保护；神经毒性；中枢神经系统中图分类号R971.2；R614.1文献标志码A doi：10.3969/j.issn.2096-3351.2021.02.018Research progress in neuroprotection and neurotoxicity of anestheticsHU Yujiao1，WU Anguo2，OU Cehua31.Department of Anesthesia；2Luzhou Key Laboratory of Activity Screening and Druggability Evaluation for Chi⁃nese Materia Medica，School of Pharmacy；3Department of Pain of Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou646000，Sichuan Province，ChinaAbstract Anesthetics possess neuroprotective effects but also certain neurotoxicity.How to achieve neuropro⁃tection and reduce neurotoxicity concurrently has become an important problem for anesthesiologists.This article re⁃views the molecular targets，neuroprotective effects，and neurotoxicity of anesthetics，as well as how to reduce the neurotoxicity of anesthetics，in order to provide a reference for the selection of anesthetics in clinical practice.Keywords Anesthetics；Neuroprotection；Neurotoxicity；Central nervous system基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81903829）；国家级大学生创新创业训练计划项目（202010632047）；泸州市人民政府-西南医科大学联合项目（2018LZXNYD-ZK42）第一作者简介：胡雨蛟，本科生。

中华行为医学与脑科学杂志 2020年 11 月第 29卷第 11 期Chin J Behav M e d Brain Sci，N o v e m b e r 2020，V〇1. 29，No. 11•971••基础研究•3xTg-AD小鼠海马突触可塑性与钙离子跨膜流动特征李奕颖1原丽2闫旭东1武美娜11山西医科大学生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，太原 030001 ;2山西长治医学院生理教研室，长治 046000通信作者：武美娜，Email: wmna@ 163. com【摘要】目的观察3xTg-A D小鼠海马突触可塑性与钙离子跨膜流动特征。

方法根据基因型不同，将6月龄小鼠分为APP/P S l/t a u三转基因AD(3xTg-A D)模型小鼠和野生型（WT)对照组小鼠两组，每组13只。

每组随机选取6只小鼠进行在体电生理记录，给予测试刺激记录其海马CA1区场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)、配对脉冲刺激记录双脉冲易化(paired-pulse facilitation，P P F)、高频刺激（high frequency stimulation,H FS)诱导长时程增强（long-termpotentiation，LTP)。

每组剩余的 7 只小鼠采用非损伤微测技术（non-invasive micro-test technology,陋T)，检测海马CA1区脑片神经元的跨膜钙内流和钙外排情况。

3xTg-A D小鼠在电生理和NM T实验中各损失1只,最终人组电生理实验5只,NM T实验6只。

采用SPSS 18.0对所有数据进行统计学分析，两组间比较使用两独立样本f检验。

结果（1)在体电生理实验中，给予测试刺激后30 min内，3xTg-A D小鼠和W T小鼠的fE P S P斜率均比较稳定，其平均fE P SP斜率分别为[(97. 8±2. 3)%]和[(92. 6± 12.6) %],两组之间差异无统计学意义（0.9105);给予配对脉冲刺激后,3xTg-A D小鼠和W T小鼠的P P F值分别为（1.58±0. 69)和（1.74±0. 17),两组间差异无统计学意义（t=0. 50,P>0.05);给予 HFS后 30 min和60 m in,3xTg-AD小鼠的 LTP值分别为[(104. 9±丨0. 9)%]和[(98. 0士10.8)%]，明显低于 WT小鼠的[(156. 5±21. 3)%] (j=4. 43，P<0. 01)和[(162. 5± 19.7)%] (« =5.92,P<0. 01)。

不同浓度BME对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响【摘要】目的：观察含10 ml/L血清的不同浓度的β一巯基乙醇(BME)对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响. 方法：从大鼠胚胎脊髓中分离神经干细胞，经过2~3次传代培养后，采用含10 ml/L血清的不同浓度的BME分组对细胞进行体外诱导，选择3个时段观察细胞形态变化情况，诱导24 h后采用GFAP和NSE免疫荧光染色法鉴定分化结果，同时对分化结果进行统计学分析. 结果：用BME( mmol/L)组和对照组血清诱导的神经元的百分率分别为49%和10%，而BME(1 mmol/L)组的神经元分化率显着升高至58%. 由BME( mmol/L)组、BME(1 mmol/L)组和对照组血清诱导的星形胶质细胞分化率分别为46%，35%和83%. 结论： BME 有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用. 配合血清使用可使细胞向神经原分化的趋势明显优于单纯使用血清，两者协同效应明显.【关键词】β一巯基乙醇(BME)；神经干细胞；细胞分化0引言β巯基乙醇(βmereaptoethanol, BME)又名2巯基乙醇，是具有硫醇臭味的无色或微黄色透明液体，作为一种化学原料药具有抗氧化作用. Woodbury等［1］证实它在诱导骨髓基质干细胞(marrow stromal cells, MSCs)向神经元方向分化的过程中起到关键作用,陈霞平等［2］对BME诱导MSCs作用也有相关报道. MSCs在被诱导分化为成熟神经细胞的过程中必定经过神经干细胞阶段. 因此，本研究将成功诱导MSCs的BME配合血清作用于神经干细胞，以观察其对神经干细胞增殖过程及分化结果的影响.1材料和方法1．1材料受孕SD大鼠(E10E12)由第四军医大学实验动物中心提供；DMEM/F12, N2添加剂均购自Gibco公司；EGF, bFGF购自Sigma公司，兔抗鼠NSE,GFAP,NESTIN一抗以及羊抗兔FITC, CY3荧光二抗均购自博士德公司；BME，多聚赖氨酸，胰蛋白酶均购自Sigma 公司. 倒置相差光学显微镜OLYMPUS IX70型.1．2方法1．2．1NSC原代培养依照Weiss的实验模型［3,4］，将孕大鼠(E10~E12)脱颈处死后，750 ml/L乙醇浸泡消毒10 min，在无菌条件下打开腹腔，取出胚胎，解剖显微镜下分离胎鼠脊髓，在4℃ DHanks液内用解剖剪将脊髓减碎成l mm×l mm×1 mm，用火焰抛光的吸管将剪碎的组织小块机械吹打成单细胞悬液，800 r/min离心5 min后弃沉渣，血细胞计数板细胞计数，以条件培养基(DMEM/F12为基本培养基，N2添加剂以1∶100稀释，EGF, bFGF［5,6］终浓度为20 μg/L. 调整细胞密度约为9×105个/L 后接种于培养瓶内，置于37℃, 50 ml/L CO2孵箱中培养. 每隔2~3 d更换新鲜培养液，5~6 d传代.1．2．2实验分组将盖玻片放入24孔板，并用多聚赖氨酸包备37℃过夜，使用前用PBS冲洗干净. 将传至第3代的神经干细胞克隆球用滴管吹打成单细胞悬液，仅使用基本培养基而不加入EGF，bFGF和N2，并稀释至×106个/L，接种到24孔板，每孔l mL细胞悬液. 每6孔为一组，共分三个试验组(A~C组)和一个对照组(D组). A~C组分别使BME终浓度达到, 1和2 mmol/L,并分别加入l/100体积浓度的胎牛血清，而D组仅加入1/100体积浓度的胎牛血清.1．2．3免疫细胞化学检测各组细胞于诱导24 h后吸干液体，40 g/L多聚甲醛(10 mmol/L PBS配置)室温固定30 min, 10 mmol/L PBS冲洗3 min×3次. 滴加山羊血清封闭，20 min后吸去余液. 加入一抗NSE(1∶250)和GFAP(1∶250)分别标记分化后的神经原和星形胶质细胞. 放于4℃过夜. 复温PBS冲洗后加入荧光二抗，2 h后甘油封片观察.统计学处理：在每张盖玻片上随机取10个视野观察，分别对每视野中NSE及GFAP染色细胞和所有细胞计数. 采用进行ChiSquare检验，认为差异有统计学意义.2结果2．1NSCs的原代培养相差显微镜观察，原代后的1~2 d里由于培养基的高度选择性和机械吹打损伤使得部分细胞死亡，绝对数量明显减少. 培养3 d后细胞快速生长，逐渐形成由数十个至数百个细胞组成体积大小不等的克隆球(neurosphere)悬浮生长(Fig 1A)，表面凹凸不平，折光性强. 随着培养时间的延长，这些克隆球不断增大，其中有个别神经干细胞生长速度明显快于其余细胞，由这个别细胞形成的新的克隆球会出现在母球表面并逐渐脱离旧的克隆球(Fig 1B). 此时如果停止传代，这些体积较大的克隆球生长减缓，折光性减弱.2．2BME对神经干细胞增殖的作用将BME 加入24孔板后，我们选择4, 12和24 h三个时间点借助倒置相差光学显微镜观察神经干细胞形态变化情况. 发现D组纯血清诱导神经干细胞大约在2 h左右即有个别细胞发生形变，4 h时明显增多. A组与对照组纯血清组几无差别，B组神经干细胞同样发生梭型变，个别细胞形似水滴状，推测是分化方向为神经元的过渡细胞(Fig 2)，但也有小部分细胞维持原状或逐渐黯淡，死亡. C 组细胞分化很少，大量神经干细胞死亡.2．3BME对神经干细胞的分化作用在纯血清对照组中，NSE和GFAP阳性的比例分别为10%和83%；A组中NSE和GFAP阳性的比例分别为49%和46%；B组中NSE和GFAP阳性的比例分别为58%和35%(Fig 3,4): C组因为大量细胞已经死亡，故未做免疫荧光染色.2．4对得到数据进行统计学分析将每组6孔每孔10个随机视野共60个NSE染色细胞数据分别记录，统计结果各组之间差异明显.3讨论以往文献中报道大鼠脊髓神经干细胞培养大都选取胎龄在13~14 d胎鼠为实验材料，但在实际操作中发现孕13~14 d胎鼠脊髓系统已初步发育成形，血管膜紧缚在上，结缔组织出现，不但增加取材难度，且使用胰蛋白酶消化时势必增加消化时间，加大对神经干细胞的损伤［7］. 在分离过程中因为出血明显，原代的培养基中势必会留有少量血清，很容易使原代大量神经干细胞分化贴壁，这对以后实验的客观性分析及试验进程都产生影响. 而孕10~12 d胎鼠脊髓尚未完全成型，还处在中空的神经管阶段. 神经干细胞含量高，活性好，较易分离. 且无需胰蛋白酶消化，小心机械吹打即可形成单细胞悬液，在本实验过程中观察发现原代极少分化.DMEM F12作为改良型的培养液，与原MEM培养液相比较营养成分加倍，对细胞的分裂增殖十分有利［8］，而且Ham F12所含微量元素非常适于无血清情况下的细胞培养. 目前进行神经组织的培养，一般以DMEM 与F12的1∶1混合培养基为基础培养基. 但现在商品化常见高糖型DMEM培养基含糖量仅为 g/L,难以满足以糖代谢为主要能源的神经细胞. 我们的实验将DMEM F12基本培养基中的葡萄糖含量添加至6 g/L，与普通高糖DMEM(糖 g/L)相比，细胞生长活力明显增强，克隆球形成更早，形态更规则，原代之后死亡细胞数明显减少.目前已知的大量神经干细胞体外诱导实验中，化学物质以其独特的优势在其中占有相当比例. 与各种生物自身因子诱导最少几日才可见效果相比，化学诱导剂往往在加入数小时内细胞就发生形变，部分诱导剂24 h左右即可完成整个诱导过程，而且结果确切高效. 以最常见的化学诱导剂RA为例,在已知文献报道中，诱导神经干细胞最终分化为神经元的比例可高达90%左右［9］. 但化学诱导剂的细胞毒性较大，长时间使用对细胞损伤较大严重制约了其在临床治疗上的应用. 在我们的试验中曾尝试将诱导剂BME以试验组相同浓度在无血清情况下加入细胞培养液中. 在随后观察中发现4 h左右就有个别细胞发生形变，但随后细胞整体状态明显下降，24 h死亡细胞过半. 在配合血清使用后仍可以发现细胞死亡程度随诱导剂浓度增加而增加. 试验组细胞在成功诱导后如不及时换掉含诱导剂培养基，换成普通培养基，细胞仍有死亡. 所以要利用化学成分对干细胞进行诱导并最终应用于临床治疗首先必须解决细胞毒性从始至终对细胞的伤害. 我们认为BME和血清的联合使用有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用，其结果明显优于单纯使用血清. 不但降低了单一使用化学成分的严重毒性，而且血清也不仅仅依靠本身的诱导作用，其含有的丰富的营养物质和生长因子对BME的诱导具有协同作用，也是一种辅助作用.【参考文献】［1］ Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons ［J］. J Neurosci Res,2000;61(4):364.［2］陈霞平，阮绪芝，张群林，等. NGF 和BME对小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用［J］.中国现代医学杂志，2004；14：20-23.Chen XP, Ruan XZ, Zhang QL, et al. Effects of NGF and BME on differentiation of mMSCs into neuronlike cells ［J］. Chin J Mod Med,2004；14：20-23.［3］ Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cell of adult mammalian central nervous system ［J］. Science, 1992;225:1707-1710.［4］章翔. 加强神经干细胞的基础与应用研究［J］. 第四军医大学学报，2003；24：2017-2020.Zhang X. Improvement on study of application and base of neural stem cell ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003；24：2017-2020.［5］ Gfitti A, Parati EA, Cova L, et al. Multipotential stem cells from adult mouse brain proliferate and selfrenew in response to basic fibroblast growth factor ［J］. J Neurosci, 1996；16(3)：1091-1100.［6］ Ciccolini F, Svendsen CN. Fibroblast growth factor 2(FGF2) promotes acquisition of epidermalgrowth factor(EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cell: Identifieation of neural precursors responding to both EGF and FGF2 ［J］. J Neurosci, 1998；18：7869-7880.［7］章翔，林绿标，姬西团，等. 外源性一氧化氮对小鼠神经干细胞增殖的抑制作用［J］. 第四军医大学学报，2004；25：297-300.Zhang X, Lin LB, Ji XT, et al. Ectogenic nitric oxide inhibits proliferation of neural stem cells in mice ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25：297-300.［8］姚柏春，黄翔. 胚胎小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化［J］. 解剖与临床，2004;9:238-240.Yao BC, Huang X. Cultivation and differentiation of embryonic striatumneural stem cells in vitro ［J］. Anatomy Clinic, 2004；9：238-240.［9］崔景彬，鄢文海，王建枝，等. 维甲酸和EGF对大鼠脑胚胎神经干细胞增殖和分化的影响［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志，2003；12：81-85.。

胞外环境Ca2+变化诱导人肿瘤细胞凋亡马靖;符乃阳;李玉梅;徐安龙【期刊名称】《中国癌症杂志》【年(卷),期】2001(011)002【摘要】目的：观察胞外环境Ca2+变化对人肿瘤细胞的直接诱导凋亡作用。

方法：通过EGTA螯合胞外Ca2+或添加CaCl2改变胞外环境Ca2+。

用PI和Hoechst33342荧光双染观察细胞核形态，用流式细胞仪检测凋亡百分率。

分别借助荧光探针Fluo-3和Rh123检测胞内Ca2+和线粒体膜电位(ΔΨm)变化。

用环孢菌素A(CsA)阻断PT孔，研究其在凋亡中的作用。

结果：胞外环境Ca2+升高或降低均诱导人胃癌MGC-803和喉癌Hep细胞凋亡，恢复胞外Ca2+阻断凋亡。

随胞外Ca2+变化胞内Ca2+相应升高或降低，但线粒体ΔΨm均表现为急剧下降。

CsA对MGC-803细胞凋亡无明显抑制作用，轻微促进Hep细胞凋亡。

结论：胞外环境Ca2+变化引起胞内Ca2+相应变化和线粒体ΔΨm下降并通过PT孔非依赖性途径诱导肿瘤细胞凋亡。

%Purpose：To study the direct apoptosis-inducing effect of extracellular calcium alterations on human tumor cells. Methods：Cells were incubated with calcium chelator EGTA to lower extracellular Ca2+ or CaCl2 to raise it. Apoptosis was detected by fluorescence microscope and flow cytometry. Intracellular Ca2+ and mitochondria transmembrane potential (ΔΨm) were measured by fluorescent probes Fluo-3 and Rh123 respectively. The role of mitochondria permeability transition pore (MTP) was also investigated by using the specific blocker of MTP, CsA. Results：Both EGTA and excessCaCl2 induced apoptosis in the human gastric cancer cell line MGC-803 and the human laryngocarcinoma cell line Hep, which was blocked by restoring extracellular calcium. The changes of intracellular calcium corresponded to the decrease or increase of extracellular calcium, whileΔΨm was dramatically decreased in both cases. CsA did not pro tect MGC-803 cells against apoptosis and slightly aggravated it in Hepcells.Conclusions：Alterations of extracellular calcium was accompanied by changes of intracellular calcium and decrease of ΔΨm and induced MTP-independent apoptosis in human tumor cell lines MGC-803 and Hep.【总页数】4页(P101-104)【作者】马靖;符乃阳;李玉梅;徐安龙【作者单位】中山大学生命科学学院生物化学系与生物医药研究中心,;广东省药品检定所,;中国中医研究院基础理论研究所,;中山大学生命科学学院生物化学系与生物医药研究中心,【正文语种】中文【中图分类】R730.23【相关文献】1.人参皂苷Rg1对H2O2诱导的HT22细胞凋亡及胞内Ca2+变化的影响 [J], 刘晓丹;成绍武;范婧莹;宋祯彦;李平;邓常清2.人牙乳头细胞分化过程中胞内Ca2+浓度变化和1,25(OH)2D3对Ca2+影响 [J], 王景杰;牛忠英;倪龙兴;张文3.胞外环境Ca2+的变化对培养的人类晶状体上皮细胞的影响 [J], 付玲玲;刘谊;张军军;李胜富;张立;代艳4.胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析 [J], DA Mengting;SHI Zhenzhen;PANG Hailong;JIA Lingyun;SUN Kun;FENG Hanqing5.胞外ATP对壳聚糖诱导的ROS和PAL活性变化的影响 [J], 杨德丽;王娟娟;庞海龙;孙坤;冯汉青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

·５３０··实验研究·激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用武美娜李新毅白玮郭芬祁金顺【摘要】目的探讨激光共聚焦扫描显微镜（ＬＣＳＭ）技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。

方法采用原代培养大鼠皮层神经元，用ＬＣＳＭ测定给ＫＣＩ前后细胞内钙离子浓度的动态变化。

结果培养神经元状态良好。

用ＬＣＳＭ准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。

结论ＬＣＳＭ在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。

【关键词】显微镜检查，共焦；细胞内钙离子浓度；皮层神经元ＵｓｅｏｆＩａｓｅｒｅｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃｏｒ－ｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓＷＵＭｅｉ－ｎａ＇，ＬＩＸｉｎ一蚋，ＢＡｌＷｅｉ，ＧＵＯＦｅｎ，ＱＩＪｉｎ－ｓｈｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ）＇，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１．Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｏｃｕｍｅｎｔｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅｓｏｆｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）ｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（『Ｃａ邳）ｊｎｓｕｂｊｅｅｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＬＣＳＭｗａｓｕｓｅ（１ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆＣａ２ｑｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＫＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｄｙｎａｍｉｃ『Ｃａ２＋］ｉｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＩ￡ＳＭ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＣＳＭｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｙｓｈｏｗｐｒｏｍｉｓｅｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｉｎｆＣａ２＋］ｉ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＯｌｌｆｏｃａｌ；ＩｎｔｒａｃｅＵｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＣｏｒｔｉｅａｌＣａ２＋是细胞内最为重要的阳离子和第二信使之一。

一、实验背景钙离子是细胞内重要的信号分子，参与调节多种细胞生理过程，如细胞分裂、分泌、收缩等。

细胞内钙离子稳态的维持对于维持细胞正常功能至关重要。

本研究旨在探究细胞内钙离子稳态的调控机制，并通过实验验证相关调控因子在钙离子稳态中的作用。

二、实验目的1. 分析细胞内钙离子浓度变化规律。

2. 鉴定参与钙离子稳态调控的关键因子。

3. 验证关键因子在钙离子稳态中的作用。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞系：小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）- 钙离子荧光探针：Fura-2 AM- 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素- 药物：氟化钠（NaF）、氟化钙（CaF2）、钙通道阻断剂（nifedipine）2. 实验仪器：- 倒置荧光显微镜- 激光共聚焦显微镜- 流式细胞仪- 低温高速离心机- 超声细胞破碎仪四、实验方法1. 细胞培养：将NIH/3T3细胞接种于6孔板，培养至对数生长期。

2. 钙离子荧光染色：将细胞用Fura-2 AM染液处理，37℃孵育30分钟，然后用荧光显微镜观察细胞内钙离子浓度变化。

3. 钙离子浓度变化实验：- 实验组：分别加入不同浓度的NaF（0.1、1、10 mM）和CaF2（0.1、1、10 mM），观察细胞内钙离子浓度变化。

- 对照组：仅加入染液，观察细胞内钙离子浓度变化。

4. 钙通道阻断实验：- 实验组：加入nifedipine（10 μM），观察细胞内钙离子浓度变化。

- 对照组：仅加入染液，观察细胞内钙离子浓度变化。

5. 钙离子稳态相关因子筛选：- 将细胞分为实验组和对照组，分别转染过表达或敲低目的基因的质粒。

- 通过荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测细胞内钙离子浓度变化。

五、实验结果1. 钙离子荧光染色结果显示，细胞内钙离子浓度在静息状态下保持相对稳定，受到外界刺激后迅速升高。

2. 加入NaF和CaF2后，细胞内钙离子浓度逐渐升高，且随着药物浓度的增加，钙离子浓度升高程度逐渐增强。