大鼠骨髓间充质干细胞重建表皮细胞及皮肤附件

骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究(一)【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用.方法：以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤，修复皮肤缺损，HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果，荧光检测追踪细胞转归.结果：移植2wk后实验组创面基本愈合，愈合时间明显快于对照组，6wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质干细胞，免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性.结论：含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进创面愈合，骨髓间充质干细胞在皮肤创伤愈合中起了重要作用，可作为组织工程领域中理想的种子细胞.【关键词】骨髓间充质干细胞；皮肤；创伤愈合；组织工程0引言随着组织工程技术的发展，开发构建组织工程皮肤逐渐引起人们的关注，但种子细胞的来源是目前困扰组织工程的问题之一.骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是近年来研究的一个热点，它来源于中胚层，有较强的自我更新和增殖能力，且取材方便，易于培养，不涉及伦理道德等问题，因而被认为是组织工程理想的种子细胞〔1〕.本研究拟用MSCs 作为种子细胞经体外培养扩增后构建组织工程皮肤，修复动物皮肤缺损，观察修复效果及细胞在体内的分化，为构建具有生理功能的组织工程皮肤奠定基础.1材料和方法1.1材料无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，采用Percoll（Sigma）分离法，经密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，PBS洗两次，离心收集细胞，重悬于体积分数为100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养达80%~90%融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养.使用前用PKH26荧光染色试剂盒（Sigma）进行荧光标记.标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光.取用荧光标记过3~5代状态良好的骨髓间充质干细胞，以1.8×106/mL的密度与提取自小牛皮的Ⅰ型胶原混合，37℃孵育30min凝固后，加入培养液培养，2d将其移至气液面进行器官培养，继续培养2d获得含有MSCs的组织工程皮肤〔2〕.1.2方法1.2.1动物创伤模型制备及移植实验实验用猪6只，雌雄不限，质量17~20kg.麻醉后背部剃毛，消毒.在每只猪脊柱两侧皮肤各制备2个直径50mm的圆形皮肤缺损，深至筋膜层，建立深层皮肤缺损动物模型（n=24），自体双侧对照，左右随机分为实验组和对照组.实验组将构建的组织工程皮肤覆盖创面，敷以无菌油纱和普通纱布，打包缝合.对照组创面未覆盖组织工程皮肤，其它治疗同实验组.术后1wk首次打开创面，常规换药.1.2.2创面观察及指标术后动物分笼饲养，每天观察活动、饮食等情况，连续观察创面变化、组织生长和创面愈合等情部至第6wk.定期取创面组织进行组织学观察，冰冻切片进行显微镜检查，免疫组织化学染色观察角蛋白（CK）和Ⅰ型胶原（collagentypeⅠ）形成情况.2结果2.1骨髓间充质干细胞原代细胞接种后成圆形，首次换液后显微镜下可见稀疏分布的单个细胞贴壁生长，细胞为纺锤形，类圆形，7d后生长速度加快，呈典型的成纤维细胞外观，约10d汇合成片即可传代.标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光.2.2组织工程皮肤光镜下可见体外培养的组织工程皮肤，与正常皮肤的真皮部分相似，表皮层缺如，真皮层较厚，但组织工程皮肤中缺少毛囊、汗腺和血管结构等.2.3术后大体与组织学观察所有实验动物到实验结束均存活，饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应.在移植后1wk，MSCs复合的组织工程皮肤与自体皮肤较好的融合，移植物颜色与自体皮肤颜色接近，随着时间延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，上皮角化不明显；移植后2wk，创面基本愈合，移植物颜色与自体皮肤颜色非常接近，瘢痕小，上皮增厚，角化明显，真皮层细胞生长良好，毛细血管大量增生.对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜色较深，到移植后第3wk才以瘢痕愈合.实验组和对照组创面的愈合时间分别为（14.2±1.5）d和（20.4±2.7）d，两组间差异有显著性（P0.05）.我们对新形成皮肤组织中的毛细血管进行了计数，发现在第6wk实验组明显高于对照组（P0.05,图1）. 2.4荧光检测荧光显微镜对实验组的组织标本进行连续检测6wk，可在皮肤组织的表皮层，真皮层和皮下脂肪层的血管周围观察到标记了红色荧光的细胞.。

MODS的其他治疗方法提高免疫能力：感染者不可单纯依赖抗生素，要提高免疫能力。

对免疫功能差的病人可考虑给予干扰素、胸腺肽。

生长激素：近年来国内外开始应用重组人生长激素于烧伤、MODS 患者。

它通过诱导肝脏产生胰岛素样生长因子（IGF）加速蛋白质合成，对高分解代谢、负氮平衡的患者有良好效果。

它还增强免疫力和心脏收缩功能，促进伤口愈合。

有报道重组人生长激素与肠外营养联合应用，能迅速有效地纠正MOF 患者的代谢障碍，提高血浆蛋白水平，增强免疫功能。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）：付小兵等给予外源性bFGF 可减轻大鼠肠缺血再灌注对肠、肝等脏器的损伤，促进其后期修复，并激活内源性bFGF 的表达。

其保护可能是早期激活p42 /p44 MAPK 信号转导途径抑制肠绒毛上皮细胞及血管内皮细胞的凋亡，并促进肠道干细胞向肠上皮细胞的增殖和分化。

大黄：景炳文、陈德昌等系统研究中药大黄对危重病的疗效。

发现大黄能保护肠粘膜屏障，有效缓解中毒性肠麻痹，提高危重病患者对肠内营养的耐受性。

其机制可能是，大黄抑制TNFα、IL-1β等基因表达，清除氧自由基，降低炎症介质磷脂酶A2、血小板活化因子浓度，因而拮抗SIRS.大黄还减轻肠缺血再灌注损伤所引起的肺损伤。

干细胞技术：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，可分化为3 个胚层几乎所有的组织，包括脑、肝、肾、脾、骨、血液、视网膜、皮肤及其附件等。

将肝细胞的干细胞导入相关生长促进基因而获得分化为肝细胞的能力，可用来治疗肝衰竭。

肺泡Ⅱ型细胞（肺的干细胞）移植治疗肺衰竭，胰岛干细胞移植治疗糖尿病，中枢神经干细胞移植产生神经元与胶质细胞治疗帕金森氏病，心肌干细胞移植治疗心肌梗死。

骨髓间充质干细胞取材方便，扩增迅速，可自体移植，在体内正常循环中可分布于多种组织和器官，是重要的组织工程种子细胞。

其增殖分裂模式易于外源基因导入和表达，故又是基因治疗的理想靶细胞。

其实际应用前景不可限量。

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究邹丽琴;苏踊跃;孙荣距;陈建;梁光萍;罗向东【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)6【摘要】目的体外分离培养骨髓间充质干细胞，并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件。

方法采用直接贴壁法，分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞，应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等，对分离的细胞进行鉴定。

以10～40ng／ml的表皮生长因子处理第3代MSCs，观察细胞角蛋白的表达。

用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系。

结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CDl06、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性，CD34为阴性，符合骨髓间充质干细胞特征。

MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7d后，免疫细胞化学结果显示，EGF 浓度为30ng／ml和40ng／ml时，细胞角蛋白出现阳性表达；体外诱导14d，呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加，同时integrin131表达量下降。

结论体外培养的MSCs在EGF诱导下，具有分化为表皮细胞的倾向，同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用。

【总页数】3页(P584-586)【关键词】骨髓间充质干细胞;表皮细胞;表皮生长因子;分化;大鼠【作者】邹丽琴;苏踊跃;孙荣距;陈建;梁光萍;罗向东【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R322.991;R329.21【相关文献】1.骨髓间充质干细胞在糖尿病模型创面中向表皮细胞分化的初步研究 [J], 钟晓红;王明刚;赵李平;高新宇2.在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察 [J], 方利君;付小兵;孙同柱;李建福;程飚;杨银辉;王玉新;王通3.在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步研究 [J], 方利君;付小兵;孙同柱;李建福;程飚;杨银辉;王玉新4.烧伤大鼠血清诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞和血管内皮细胞的实验研究[J], 韩冰;付小兵;梁雪梅;周岗;白晓东;孙丹;陈伟;孙同柱5.补肾活血汤含药血清干预体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化及补肾活血汤联合骨髓间充质干细胞治疗大鼠膝骨关节炎的实验研究 [J], 吴刚;童培建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤目的：体外培养扩增sD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步-临床应用奠定基础。

方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。

观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。

结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。

结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。

标签：骨髓间充质干细胞；脱细胞真皮；组织工程皮肤对于大面积皮肤缺损患者，尽早在功能和外观上修复创面对降低病人的死亡率、提高病人的生存质量极为重要。

但由于自体皮源不足和取皮本身又造成新的皮肤缺损等原因，限制了自体皮移植的应用。

组织工程皮肤的研制和应用为大面积皮肤缺损患者带来了福音，但也存在着种子细胞来源不足和理想的支架材料没找到等问题。

骨髓问充质干细胞是具有多项分化能力的成体干细胞，在皮肤创面微环境下，它可以分化为表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，另外，它还可分泌多种生长因子，促进创面愈合，有望成为皮肤组织工程理想的种子细胞。

组织工程化脱细胞真皮基质是一种新开发的组织工程支架材料，具有组织相容性好，适于组织再生等优点。

本研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞，以组织工程化脱细胞真皮为支架载体，体外联合培养，以期构建组织工程皮肤。

1材料和方法1．1材料：SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，Percoll淋巴细胞分离液(1.073g/ml，购自美国Pharmacia公司)，DMEM－F12培养基(购自美国Sigma公司)，胰酶(购自美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青犊牛应用研究所)，超净工作台(Nuair)，CO2孵箱(Nuair)，倒置显微镜(Olympus)1．2方法与步骤1．2．1组织工程化脱细胞真皮基质的制备：在无菌条件下，将BAM用醋酸溶液溶解后，加入1/10体积的胎牛血清和10X的DMEM培养基，调节pH 值为7.2，加入培养的成纤维细胞，使终浓度为106个细胞/ml，再将BAM—细胞悬液加至培养皿中，在37℃、5％CO2条件下固化30min，再加入器官培养液；每天换液，37℃条件下连续培养10天。

骨髓间充质干细胞对大鼠皮肤缺损的实验治疗【摘要】目的探讨采用培养干细胞移植治疗重度皮肤缺损。

方法将Wistar 大鼠随机分为干细胞治疗组，培养液对照组和空白对照组。

取骨髓间充质干细胞(BMSCs)经体外培养后，应用于皮肤重度缺损的异体大鼠创面上，以平均愈合时间和平均愈合速度为指标，观察各组动物损伤皮肤的修复情况。

结果干细胞治疗组皮肤修复速度为(42.42±2.07) mm2/d；平均愈合时间为11.63±4.18 d，明显高于对照组。

经统计学处理治疗组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

结论利用同种异体干细胞进行皮肤损伤的治疗效果明显，为临床治疗开辟了一条新途径。

【关键词】骨髓间充质干细胞；大鼠；皮肤缺损大面积的皮肤缺损，目前的治疗手段以皮肤移植为主，但这一方法不可避免地在患者己损伤的肌肤上再次形成新的创伤。

如何能使缺损皮肤尽快修复，又避免损伤完整健康的皮肤，己成为迫切需要解决的难题。

作者在干细胞课题的研究过程中根据干细胞的生理特性，使用BMSCs体外培养后，对重度皮肤缺损的大鼠进行治疗，取得满意疗效。

1 材料和方法1.1 实验动物出生5 d的Wistar乳鼠，体重8.0~10.0 g；成年Wistar雄性大鼠，清洁级，体重220~260 g。

吉林大学实验动物中心提供。

1.2 干细胞制备无菌条件下分离乳鼠干骨，冲出骨髓，制成细胞悬液，L DMEM液培养。

传至第5代，经胰酶消化，培养液洗细胞三次，调整浓度为1.0×107/ml 备用。

1.3 创面制备Wisteria大鼠经2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，剪除脊部被毛，70%酒精清洁，消毒，无菌条件下切除面积为9 cm2(直径约3.4 cm)圆形皮肤，深达皮下组织全层(勿伤及皮下筋膜层)，造成重度皮肤缺损。

为避免模型动物相互影响，采取单笼饲养。

1.4 实验分组及干预将30只大鼠随机分成3组，每组10只。

大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞AbstractAIM: To explore the plasticity of transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSC) into corneal epithelial cells. METHODS: MSC of adult rats that were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with an attachment culture method. The transdifferentiation of MSC into corneal epithelial cells were induced in vitro by co-cultured with corneal stromal fibroblasts. The expression of K12 on MSCs which is expressed specially in corneal epithelial cells was identified by immunofluorescent staining. RESULTS: MSC cultured in vitro showed great potential of proliferation. CD29 was positive， and CD34， CD45 were negative in cultured cells， indicating that the cultured cells were MSC. After co-cultured with corneal stromal fibroblasts for one week， MSC expressed K12， indicating that they had been transdifferentiated into corneal epithelial cells. CONCLUSION: The data suggests that MSC have the potential to transdifferentiate into corneal epithelial cells in vitro.· KEYWORDS: mesenchymal stem cell; corneal epithelial cells; transdifferentiation摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。

骨髓间充质干细胞分化为皮肤组织的实验研究中文摘要实验目的皮肤创伤后的组织细胞再生修复及愈合，是由邻近、健在的细胞分裂、增殖来实现的。

然而，大面积皮肤缺损如烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损、皮肤溃疡等，仅靠创面自身难以实现皮肤的再生，需要足够的皮肤替代物修复。

临床常用的修复方法存在着许多缺点，如造成新的创面，并且当大面积皮肤缺损患者尤其是烧伤患者缺乏足够的自体皮肤，而异体皮移植存在免疫排斥反应。

涉及真皮层的缺损由于愈合时间过长，缺乏表皮覆盖，出现感染、瘢痕的机率大大增加。

因此能够快速覆盖创面，具有重要的理论价值和治疗意义。

干细胞技术的出现为解决这一难题提供了新的手段。

干细胞具有自我复制的能力，在一定条件下，它可以分化成各种功能细胞。

根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体于细胞。

胚胎干细胞的研究受到伦理学方面的困扰，细胞来源等方面的限制，因而成体干细胞的研究便受到人们的高度重视。

越来越多的证据表明，骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）有多分化潜能，移植入体内后可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、血管内皮、肝脏、神经等多种组织细胞。

能够作为组织工程中不同细胞的来源：在体内正常循环中能够分布于多种组织和器官，可以用于细胞和基因治疗。

而且取材、分离培养、扩增以及导入外源基因也相对方便。

ＭＳＣｓ通过抽取自体骨髓得到，对病人造成创伤较少，且无免疫排斥反应。

因此，ＭＳＣｓ在将来实际应用时就具有潜在的优势。

大多数观点认为，ＭＳＣｓ的分化与微环境密切相关。

可能是不同组织的微环境中含有不同的因子，促进进入不同组织的ＭＳＣｓ获得靶组织的表型，向不同谱系分化。

本实验拟用猪骨髓间质干细胞体外分离培养，标记后回植到猪皮肤内以及在体外不同培养基的诱导下，进行分化诱导，观察在皮肤微环境中能否分化为皮肤的血管内皮细胞和表皮细胞，从而为皮肤组织的修复重建提供新思路。

实验方法～、猪ＭＳＣｓ的体外分离培养及鉴定ｌ、分离培养扩增：从成年健康小型香猪髂骨抽取骨髓，密度梯度离心分离后置沉淀细胞入培养液培养，２４ｈ后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，每隔３～４ｄ换液，接近融合的ＭＳＣｓ按ｌ：３比例传代培养，留取第三代备用。