实验7、酸奶中乳酸菌的分离纯化

牛奶中细菌的分离实验报告乳酸菌的分离和酸奶的制作实验目的：1.掌握分离纯化微生物的基本方法2.掌握酸奶制作的基本原理3.学会酸奶的制作方法。

实验设备与材料，1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。

2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。

3、培养基：乳酸菌分离用乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。

配制250mL/组，装于2个三角瓶。

实验原理，酸奶制作的基本原理：（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。

生理生化原理：牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。

酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。

实验方法步骤：乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法1、倒平板（约6块/100ml）2、制备酸奶稀释液：（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；（2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液；（3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。

发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作学院生命科学学院专业应用生物教育班级12应生A班姓名李顺昌学号124120218实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作指导教师许波开课学期2014—2015学年下学期实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的1.掌握分离纯化微生物的基本方法2.掌握酸奶制作的基本原理3.学会酸奶的制作方法二、实验设备与材料1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。

2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。

3、培养基：乳酸菌分离用乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。

配制250mL/组，装于2个三角瓶三、实验原理1、酸奶制作的基本原理（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。

（2）生理生化原理牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。

3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。

四、实验方法步骤（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法1、倒平板（约6块/100ml）2、制备酸奶稀释液（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；（2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液；（3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。

乳酸菌的分离与纯化实验报告一、实验目的：1. 掌握乳酸菌的分离与纯化方法；2. 学习乳酸菌的形态特征及生长特性；3. 熟悉微生物实验室操作规范和安全注意事项。

二、实验原理：乳酸菌属于革兰氏阳性细菌，可以利用革兰染色方法进行初步鉴定。

乳酸菌的形态特征有很大差异，有的呈短杆状、短圆柱状，有的呈梭形或球形。

乳酸菌的培养基选择要根据实验目的而定，一般常用的是MRS培养基。

常规乳酸菌分离方法有两种：血漂白法和渐进稀释法。

血漂白法是用过氧化氢或次氯酸钠等对血液进行漂白处理后加入培养基进行分离，由于血液中含有多种抑菌物质，故需漂白处理后方能使用。

渐进稀释法则是将混菌液逐步稀释后按一定比例接种于选定的培养基上，经过多次传代，可得到单一的菌落。

三、实验步骤：1. 取适量样品加入1ml生理盐水中，充分摇匀。

2. 再从上述稀释液中取出1ml加入9ml生理盐水中，得到10-2悬液。

3. 再抽取1ml悬液加入9ml生理盐水中，得到10-3悬液。

4. 分别取适量的10-2和10-3悬液接种于MRS培养基上，并分别转移多次，培养时间一般为24-48小时，必要时可延长到72小时。

5. 分离菌落后进行鉴定。

四、结果及分析：实验结果显示，经过分离培养，从10-2和10-3悬液中分别分离出了多个菌落，经过重复转移，逐步稀释，最终获得了单一的菌落，可见分离培养方法的有效性和行之有效的可行性。

鉴定乳酸菌的一般方法包括形态学鉴定、生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。

形态学鉴定包括形态、大小、形状和染色等方面；生化特性鉴定则主要包括代谢途径、酸产生量和果糖发酵能力等；分子生物学鉴定则是通过特异性引物扩增菌株中的核酸，进行分子水平鉴定。

五、实验心得：本次实验通过乳酸菌分离、培养和鉴定的过程，使我对乳酸菌的形态特征、生长特性和鉴定方法有了更深入的了解。

同时，要时刻注意实验室的操作规范和安全问题，确保实验顺利进行。

在今后的实验中，我将更加重视实验操作的规范性和安全性。

乳酸菌的分别.纯化与判定第一部分：乳酸菌的分别.纯化一.实验器材:新颖乳酸饮料（市售）.脱脂奶粉.蔗糖.1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿.无水乙醇).酵母膏.琼脂.革兰氏染液（结晶紫染液.卢戈氏碘液.95%乙醇.沙黄）.75%乙醇.喷鼻柏油.1mol/LNaOH.1mol/L HCl.碳酸钙;0.4gNaOH固体.4.2ml浓HCL(剖析纯) .20gCaCO3固体.酵母膏20g .琼脂30g喷鼻柏油.脱脂奶粉100g .蔗糖10g;2.仪器与装备高压蒸汽灭菌锅.光学显微镜.造就箱.pH试纸.酸乳瓶.造就皿（φ9或φ12）.试管.300ml三角瓶（带玻珠）.移液管.天平.500ml锥形瓶.250ml锥形瓶.250ml烧杯.二.实验步调：1.造就基配制（BCG牛乳造就基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,参加1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混杂平均后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿参加20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热消融,用周详pH试纸调节pH到6.8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min.以无菌操纵趁热将(A)(B)溶液平均混杂.2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml,1%草酸氨水溶液80ml.将两液混匀,放置24小时后过滤即可.2.2 卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml.先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后参加碘使之完整消融,再参加蒸馏水300ml即成.2.3 蕃红溶液：番红2.5g,95%乙醇100ml,消融后存于密闭的棕色瓶中.用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可.2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g,95%乙醇300ml;B液：0.01% KOH 100ml.混杂A和B液即成,按1：100稀释即可. 2.4 心理盐水：称取9g氯化钠,消融在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升.取1干净三角瓶,盛以225ml心理盐水;7只干净试管,各盛9ml的心理盐水;加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min,得到无菌心理盐水.将酸奶样品搅拌平均,用无菌移液管汲取样品25ml参加盛有225ml无菌心理盐水的三角瓶中,在旋涡平均器上充分振摇,使样品平均疏散,即为10-1的样品稀释液;将7只装9ml心理盐水的无菌试管,依次标识表记标帜 10-2.10-3.10-4.10-5.10-6.10-7,再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中,稀释混匀便得到10-2稀释液,如斯反复依次制得10-3～10-7的稀释液.取无菌平板12个,编号标明10-1.10-5.10-6.10-7各三套;将经高温消毒的造就基冷却到50℃阁下,按无菌操纵法倒12只平板,每皿约15ml;平置使造就基平均散布在皿底,待凝固.A．平板划线接种环挑取10-1菌液,按无菌操纵对标有”10-1”的3个平板进行划操纵;划线完毕后,盖上皿盖,倒置放在40℃恒温造就箱中造就48小时.B．平板涂布用三支1ml无菌移液管分别汲取10-5.10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml,对号接种于与之对应的3个无菌平板中,每个平皿放0.1ml;尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布平均,平放于实验台上20 Min;然后倒置于40℃恒温箱中造就48小时.直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克,水95克（蔗糖与水的比例在1：10的规模内）的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min.恒温造就48小时事后,掏出造就平板;选择菌落散布较好的平板,先对其菌落形态进行不雅察,初步找出乳酸菌菌落.乳酸菌的菌落很小,大约1~3 mm,园形隆起,概况滑腻或稍光滑,呈乳白色.灰白色或暗黄色;在产酸菌落四周还能产生CaCO3的消融圈.40℃造就48h,如消失圆形稍扁平的黄色菌落及其四周造就基变成黄色者初步定为乳酸菌.拔取乳酸菌典范菌落转致脱脂乳试管中,40℃造就8~24h若牛乳消失凝固,无气泡,显酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色显阳性,则可将其持续传代3次,最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管,作菌种待用.发酵：不雅察BCG造就基中乳酸菌菌落特点,拔取长势比较好的菌落无菌操纵下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中,40～42℃静止造就.取清洁载玻片一块,在载玻片中心加一滴心理盐水,无菌操纵法取少量菌体涂片;结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染,湿润后用油镜不雅察,菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌;个中保加利亚乳杆菌呈杆状,成单杆.双杆或长丝状;嗜热链球菌,呈球状,成对或短链或长链状. 革兰氏阳性,无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌,记载测定成果.第二部分：乳酸菌判定一.实验器材1.蛋白胨水造就基：蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4121 摄氏度湿热灭菌 20 min2.糖发酵造就基：蛋白胨水造就基 1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配 20%糖溶液（葡萄糖,蔗糖）各10 ml.3.有关试剂1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫 1.6 g 溶于100 ml乙醇中,贮存于棕色瓶中保管备用.吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml.10 % 硫酸,2 % 高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银消融后,掏出10 ml 备用,向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水,即可形成很厚的沉淀,持续滴加氨水至沉淀方才消融成为澄清溶液为止,再将备用的硝酸银慢慢滴入,则溶液消失薄雾,但轻轻动摇后,薄雾状的沉淀又消掉,持续滴入硝酸银,直到动摇后仍呈现稍微而稳固的薄雾状沉淀为止.二.判定实验采取牛肉膏蛋白胨造就基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下造就20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特点的不雅察.染色办法：涂片固定;草酸铵结晶紫染1分钟;自来水冲洗;加碘液笼罩涂面染约1分钟;水洗,用吸水纸吸去水分;加95%酒精数滴,并轻轻动摇进行脱色,20秒后水洗,吸去水分;蕃红染色液（稀）染2分钟后,自来水冲洗.湿润,镜检.2.发展前提实验(1)耐盐性实验(NaCl 浓度:0. 85 .1. 20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱实验(p H :4. 3 .5. 7 .6. 8 .8. 4 .8. 6 和8. 7) ;(3)温度梯度实验(温度: 10℃.30℃.40℃.50℃.55℃.60℃和65℃) .分别将参试菌接种于以上处理的液体造就基中造就48 h ,记载发展状态.3.厌氧发展测定将菌种接入养分肉汤平板后,用密封带包好放入CO2造就箱37℃造就2天后,不雅察发展情形,发展则为阳性.含硝酸钾的养分肉汤参加2g硝酸钾入养分肉汤4.心理生化实验⑴过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY造就基斜面上,37℃造就20h—24h,取一环接种的造就物,涂于清洁的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反响,无气泡为阴性反响.蛋白胨.酵母膏.葡萄糖（PGY）造就基：蛋白胨10g,酵母膏5g ,葡萄糖1g,蒸馏水1L .(2)甲基红（M.R）实验接种实验细菌于PYG造就基,于37℃造就2天后,于造就物中参加几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,暗示阳性.(3)吲哚实验1）.试管标识表记标帜：取装有蛋白胨水造就基的试管2支,分别标识表记标帜乳酸菌和空白对比.2）.接种造就：以无菌操纵分别接种少量菌苔到标识表记标帜乳酸菌的试管中,标识表记标帜有空白对比的不接种,置37摄氏度恒温箱中造就24~48小时.3）.不雅察记载：在造就基中参加乙醚1~2 ml ,经充分振荡,使吲哚萃取至乙醚中,静置少焉后乙醚层浮于造就液的上面,此时沿管壁迟缓参加5~10滴吲哚试剂,若有吲哚消失,乙醚层呈玫瑰色,此为吲哚实验阳性反响,不然为阴性反响.(4).糖发酵实验1）.试管标识表记标帜：取分别装有葡萄糖,蔗糖发酵造就液试管各2支,每种糖发酵试管平分别标识表记标帜乳酸菌和空白对比. 2）.接种造就：以无菌操纵分别接种少量菌苔至以上各响应试管中,每种糖发酵造就液的空白对比均不接菌.将装有造就液的杜氏小管倒置试管中,置37摄氏度恒温造就箱中造就24小时,不雅察成果.3）.不雅察记载：与对比管比较,若接种造就液保持原由色彩,其反应成果为阴性;假如造就液呈黄色,反应成果为阳性.造就液中的杜氏小管内有气泡为阳性反响,杜氏小管内没有气泡为阴性反响.(5).乳酸的检测选用已经分别的菌种做小型发酵实验,取发酵液的上清液约10 ml于试管中,参加10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛,把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中,微火加热试管至沸,不雅察滤纸变更.（6）乙酰甲基甲醇实验（V-P实验）接种新颖的实验菌种于造就基中, 37℃造就2天后,取葡萄糖蛋白胨造就液1mL在个中参加1ml 10％的NaOH,混匀,再参加3－4滴2%氯化铁溶液.数小时后,造就基概况的基层消失红色者,为阳性.（7）明胶液化实验将实验菌接种于明胶基本造就基中,置37℃造就,以一支未接种的试管作为对比.将接种的和未接种的对比管置于冰箱或冷水中,等待对比管凝固跋文录实验成果,反复不雅察比较多次.如对比管凝固时,接种管液化为阳性反响,凝固为阴性反响明胶造就基成分：NaCl 5g,蛋白胨10g,牛肉膏3g,明胶120g,蒸馏水1000mL.制法：在水浴锅中将上述成分熔解,不竭搅拌.熔解后调pH 7.2~7.4,121°C 灭菌30min.(8)石蕊牛奶的反响牛奶中重要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中参加石蕊是作为酸碱指导剂和氧化还原指导剂.石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白.不雅察其产酸.产碱.胨化.酸凝固.凝乳酶凝固.还原情形.。

一、实训目的本次实训旨在通过实验操作，掌握乳酸菌的检测方法，了解乳酸菌的基本特性，提高对微生物检测技术的实际操作能力，并加深对乳酸菌在食品、医药等领域的应用认识。

二、实训时间2023年10月25日至2023年11月5日三、实训地点生物实验室四、实训内容1. 乳酸菌样品的采集与处理2. 乳酸菌的分离纯化3. 乳酸菌的形态观察4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定5. 乳酸菌产酸能力的测定五、实训方法1. 乳酸菌样品的采集与处理（1）采集：从市场上购买含有乳酸菌的酸奶、酸奶饮料等样品。

（2）处理：将样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，制成系列稀释液。

2. 乳酸菌的分离纯化（1）平板划线法：将稀释后的样品涂布在MRS平板上，用无菌接种针进行划线。

（2）培养：将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（3）挑取单菌落：根据菌落的特征，挑取疑似乳酸菌的单菌落。

3. 乳酸菌的形态观察（1）制作临时玻片：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，用无菌盖玻片覆盖。

（2）显微镜观察：在显微镜下观察乳酸菌的形态、大小、排列等特征。

4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定（1）革兰氏染色：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。

（2）生化反应：进行糖发酵试验、氧化酶试验、V-P试验等。

5. 乳酸菌产酸能力的测定（1）制作MRS培养基：按照实验要求配制MRS培养基。

（2）接种：将挑取的单菌落接种于MRS培养基中。

（3）培养：将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（4）测定pH值：使用pH计测定培养基的pH值，计算产酸能力。

六、实训结果与分析1. 乳酸菌样品的采集与处理采集了5个样品，均成功制成系列稀释液。

2. 乳酸菌的分离纯化共分离纯化出10个疑似乳酸菌的单菌落。

3. 乳酸菌的形态观察在显微镜下观察到乳酸菌为杆状，大小约为0.5～1.0μm，排列呈链状。

4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定10个疑似乳酸菌均呈革兰氏阳性，能发酵乳糖，不产生硫化氢，氧化酶试验阴性。

酸奶中乳酸菌的分离与纯化酸奶中乳酸菌的分离与纯化一、实验目的1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。

二、实验设备及材料培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。

实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。

三、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。

大多数不运动，少数以周毛运动。

菌体常排列成链。

根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。

在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。

乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。

四、实验步骤1.乳酸菌培养基的制作配方牛肉膏 2.0g蛋白胨 2.0g酵母膏 2.0g番茄汁40g葡萄糖 2.0g吐温0.10mL碳酸钙 3.4g溴甲酚绿0.02g琼脂2～4g水200mL①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。

②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。

依次加入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。

③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。

④加棉塞、包扎⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20min。

⑥无菌检查2.倒平板将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。

3.制备稀释液量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。

用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。

然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10?3、10?4、10?5各种稀释度的酸奶稀释液。

实验十一酸奶中乳酸菌的分离纯化一、实验目的学习从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化的方法，并进一步了解乳酸菌的生长特性。

二、实验材料和用具嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus casei），乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。

BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基（CMRS）、脱脂乳粉、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200 - 280mL）、培养皿、试管、300mL三角瓶。

三、操作步骤1.分离：取市售新鲜酸乳液稀释至10-5，取其中的10-4 10-5 2个稀释度的稀释液各0.1-0. 2mL，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接灌注法分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

2.鉴别选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。

四、注意事项采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。

BCG牛乳培养基（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500Ml，加入1.6%溴甲酚绿（B. C. G）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。

（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121℃湿热灭菌20min。

以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。

乳酸菌培养基（CMRS）蛋白胨5g；牛肉膏 5 g ；酵母浸膏 2.5 g ；乳糖7.5 g；土温80 0.5ml；磷酸氢二钾1g ；乙酸钠 2.5g ；柠檬酸二铵1g ；七水硫酸镁0.1g ；四水硫酸锰0.1g ；番茄汁50ml；琼脂条9g；加入500ml蒸馏水中加热溶解，调pH值为6.8，115℃，灭菌15分钟。

《微生物学综合实验》实验报告2012.10一．实验目的1.从乳制品中分离纯化活性乳酸菌2.利用革兰氏染色等手段对分得菌株进行形态学鉴定3.通过16S rDNA序列测定及分析，鉴定分得菌株的种属4.利用Sequence Scanner V1.0软件及MEGA4软件构建待鉴定菌株的发育树，并进行序列同源性分析；5.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；6.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；7.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌8.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。

了解酸奶中乳酸菌分离原理,观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法9.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。

明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法10.初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法11.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性二．实验原理1.菌株分离纯化平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而形成多个相互独立的单菌落。

通常认为这种单菌落便为某种微生物的“纯种”。

MRS培养基是经特殊设计，专门用于乳酸菌培养、富集、分离纯化的培养基。

本实验采用划线分离法，在MRS培养基上划线稀释不同品牌的酸奶原液，以期分得乳酸菌纯种。

2.革兰氏染色革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。

实验四鲜奶的乳酸发酵及乳酸杆菌的分离纯化一、实验目的1.掌握酸奶的制作工艺;2.掌握乳酸杆菌发酵鲜奶的原理;3.掌握分离纯化乳酸杆菌的方法.二、实验原理无氧，菌乳酸菌糖乳酸酸奶酸奶发酵过程是双菌或多菌的混合培养实现的。

酪蛋白小肽或氨基酸促进球菌生长、甲酸促进杆菌产生中间有大量的乳酸、乙醛、双乙酰产生乳酸菌发酵过程是双菌或多菌的混合培养实现的，酪蛋白分离成小肽或氨基酸，促进球菌的生长，产生大量的乳酸、乙醛、双乙酰。

乳酸菌利用牛奶为底物进行厌氧发酵，得到主要发酵产物乳酸。

三、实验材料与仪器材料：纯牛奶，乳酸菌（益力多），白砂糖；仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱。

四、实验步骤（一）酸奶的制作1、配奶：150mL的纯牛奶加15~20g白砂糖，搅拌好，砂糖需完全溶解；2、接种：按总体150mL鲜奶加15mL益力多，桌面上水平摇匀10min；3、装瓶4、保温：40~42度，3~4h，常观察，整瓶上下层均出现凝乳时停止培养，转至4~5度低温下冷藏1~2h。

5、加热：低温后加热6、品尝：口感与风味接种剂品牌PH 凝结程度口感香味异味品评益力多 6.0 无凝结甜，无酸味奶香无太甜（二）乳酸杆菌的分离纯化益力多中乳酸菌的分离，按10倍稀释法，原液大约为109/mL编号 1 2 3 4 5 6 7 810倍108/mL 107/mL 106/mL 105/mL 104/mL 103/mL 102/mL 10/mL 划线法每组做四种浓度，每种浓度2个平行，划八个皿，37度倒置培养。

纯化：划线，染色（划一个单菌落在载玻片，用10uL的水涂匀，烤干，加一滴美篮染色，烤干，加香柏油，在油镜下观察）分离：取以上培养的两个浓度，分别取一个单菌落接到一个新的培养皿上，同样条件继续培养。

五、结果与讨论1、鲜奶的乳酸发酵图一图二图一图二便是我做的乳酸发酵结果，从图中可以明显的看到奶瓶中并未出现凝结情况，牛奶还是呈现液状，开启品尝后发现口味很甜，似乎乳酸菌并未利用糖进行发酵或者是因为我们使用的从超市买回来的罐装鲜奶中含有较高浓度的防腐剂，从而抑制乳酸菌的生长，导致乳酸菌的发酵能力大打折扣，因此鲜奶并未如预期那样成功发酵成酸奶。

酸奶中乳酸菌的筛选试验一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法二、实验原理：市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。

、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。

.筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离三、实验药品及仪器牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。

仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机四培养基类型①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。

乳酸菌的分离纯化乳酸菌的分离与纯化1. 实验目的2. 实验材料2.1试验设备天平、牛角匙、电炉、pH 试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、500mL锥形瓶两个、250mL 锥形瓶两个、试管20只、500mL 烧杯两个、250mL 烧杯两个、100mL 烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。

2.2实验仪器酒精棉、冰箱。

2.3实验药品新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、诗坛酸复红染液。

3. 试验方法及操作过程3.1BCG 牛乳培养基配方及灭菌（A）液：脱脂奶粉10 克，水50ml，加入 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃ 灭菌20min 。

（B）液：酵母膏 1 克，水50克，琼脂 2 克，pH6.8，121℃灭菌 2.min。

按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl 调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。

琼脂完全溶解后倒入250mL 的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布）再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。

在高压锅中，在1kg/cm2 压力下维持30min。

3.2倒BCG 培养基平板的方法将灭好菌的A 液和 B 液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。

（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌） 3.3脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10 克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3 为宜，115℃灭菌15min。

酸奶中保加利亚乳酸杆菌的分离纯化一、实验目的提取分离酸奶中的保加利亚乳酸杆菌得到纯培养。

二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或者某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

平板分离法主要有以下两种：1、平板划线分离法，2、稀释涂布平板法。

分离微生物根据不同的材料，可以采取不同的方法，将待培养菌液经过适当稀释，涂布在平板上，经过培养后再平板上形成肉眼可见的菌落，由于待培养菌液样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞，因此其最终目的是要在培养基上出现欲分离的微生物的单个菌落，再对单菌落进一步分离纯化，在稀释平板法分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。

三、材料用具1、样品：酸奶10ml2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）3、溶液试剂：10%的酚，盛有90ml水的三角烧瓶，用三角烧瓶装的100ml水。

4、仪器用具：三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，培养皿，试管，接种环，1ml移液管，10ml移液管，酒精灯，电子天平，高压蒸汽灭菌锅等等。

四、实验步骤1、培养基的制备：根据牛肉膏蛋白胨培养基的配方比例，准确称取0.6g牛肉膏，2g蛋白胨，1g氯化钠，3~4g琼脂，200ml水溶解在三角烧瓶中，调节pH在7.0~7.2左右。

取两支试管，将培养基注入约1/5试管高度的，用塞子塞好。

2、高压灭菌：将盛有90ml水的三角烧瓶，装有100ml水的三角烧瓶，两支注入培养基的试管，试管，平皿，移液管等放入高压蒸汽灭菌锅内，用0.1MPa,121℃高温灭菌20分钟。

3、倒平板：灭菌结束取出后，待培养基冷却至55~60℃时，无菌操作倒入5个已灭菌的平皿中约15ml，加盖后轻轻摇匀培养基使其分布在平皿底部，平置于桌面上，待凝后即为平板。

将注入有培养基的试管倾斜使其中的培养基成斜面约占试管的一半左右，保持倾斜待凝后即制成培养斜面。

4、杆菌稀释液的制备：取5支试管分别准确加入9ml无菌水，再量取10ml酸奶，加入已灭菌的盛有90ml无菌水的三角烧瓶中即制成10﹣1稀释液，接着用无菌移液管吸取1ml稀释液加入装有9ml无菌水的试管中制成10-2稀释液，以此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6几种稀释度的稀释液。

乳酸菌的分离‎与纯化及土豆‎（大豆）发酵1．乳酸菌的种类‎、形态、生理生化特征‎乳酸菌指发酵‎糖类主要产物‎为乳酸的一类‎无芽孢、革兰氏染色阳‎性细菌的总称‎。

大多数不运动‎，少数以周毛运‎动。

菌体常排列成‎链。

在其发酵产物‎中只有乳酸的‎称为同型乳酸‎发酵，而产物中除乳‎酸外还有较多‎乙酸、乙醇、CO２等物质‎的称为异型乳‎酸发酵。

有微好氧菌和‎专性厌氧菌。

根据细胞形态‎为球状或杆状‎，可分为两大类‎，即乳酸链球菌‎族（Strept‎o cocce‎a e）和乳酸杆菌（Lactob‎a cille‎a e）。

乳酸链球菌族‎，菌体球状，通常成对或成‎链，在固体培养基‎上菌落较小，生长缓慢。

多数为同型发‎酵，如链球菌属（Strept‎o coccu‎s），是与人类关系‎密切的重要菌‎群，有些菌是人和‎温血动物的致‎病菌；有些是人体的‎正常菌群存在‎于口腔和肠道‎；有些是乳制品‎及植物发酵食‎品中的常用菌‎，常在食品工业‎中使用，如乳链球菌（S．lactis‎）。

少数为异型发‎酵，如肠膜状明串‎珠菌（Leucon‎o stocm‎e sente‎r oides‎）是制药工业上‎生产右旋糖酐‎（即代血浆）的重要菌种，但也是制糖工‎业的一种害菌‎，常使糖汁发粘‎稠而无法加工‎。

乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。

在BCG 牛乳培养基琼‎脂平板上，乳酸菌菌落大‎约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍‎粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄‎色；在产酸菌落周‎围还能产生C‎aCO3的溶‎解圈。

乳酸菌革兰氏‎染色呈阳性，涂片镜检细胞‎杆状或链球状‎。

2.实验材料2.1试验设备天平1个、牛角匙、电炉1个、 pH试纸（1套）、 100ml量‎筒（2个）、漏斗、漏斗架（1套）、玻璃棒（2根）、棉塞、培养基（15个）、无菌移液管（3支）、牛皮纸（5张）、线绳、标签、 500mL锥‎形瓶3个、 250mL锥‎形瓶2个、试管20只、 500mL烧‎杯2个、 250mL烧‎杯2个、 100mL烧‎杯2个、酒精灯2个、石棉网1个、接种针（环）2个。

乳酸菌的分离一、实验目的: (1)了解乳酸菌的菌落特征及细胞形态；(2)了解乳酸菌的分离及鉴定原理。

二、实验内容: 酸乳中乳酸菌的分离及初步鉴定(1)从酸乳中分离乳酸菌；(2)对乳酸菌进行初步鉴定。

三、实验器材:样品：含乳酸菌的酸奶；培养基：BCG牛乳培养基；设备：高压蒸汽灭菌锅，电磁炉，恒温培养箱；仪器用品：1000ml烧杯一个，500ml量筒一个, 无菌培养皿12个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。

药品：结晶紫，乙醇，草酸氨，碘，碘化钾，番红，番红，NaOH，NaCl。

三、实验原理:自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质,用以培养,分离,鉴定,保存各种微生物和代谢产物。

此次分离纯化乳酸菌采用BCG牛乳培养基[3]。

乳酸菌分离目的是要在培养基上出现乳酸菌的单个菌落，为此我们采用以下两种方法：平板划线法：平板划线分离法是将混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后繁殖成单菌落；从而得到待分离菌种的纯种。

其原理是将微生物在固体培养基表面多次做”由点到线”稀释而达到分离的目的。

平板涂布法：平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。

乳酸菌的分离一、实验目的: (1)了解乳酸菌的菌落特征及细胞形态；(2)了解乳酸菌的分离及鉴定原理。

二、实验内容: 酸乳中乳酸菌的分离及初步鉴定(1)从酸乳中分离乳酸菌；(2)对乳酸菌进行初步鉴定。

三、实验器材:样品：含乳酸菌的酸奶；培养基：BCG牛乳培养基；设备：高压蒸汽灭菌锅，电磁炉，恒温培养箱；仪器用品：1000ml烧杯一个，500ml量筒一个, 无菌培养皿12个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。

药品：结晶紫，乙醇，草酸氨，碘，碘化钾，番红，番红，NaOH，NaCl。

三、实验原理:自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质,用以培养,分离,鉴定,保存各种微生物和代谢产物。

此次分离纯化乳酸菌采用BCG牛乳培养基[3]。

乳酸菌分离目的是要在培养基上出现乳酸菌的单个菌落，为此我们采用以下两种方法：平板划线法：平板划线分离法是将混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后繁殖成单菌落；从而得到待分离菌种的纯种。

其原理是将微生物在固体培养基表面多次做”由点到线”稀释而达到分离的目的。

平板涂布法：平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。