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蛋白质及氨基酸的测定

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食品分析课件6.蛋白质及氨基酸的测定

食品分析课件6.蛋白质及氨基酸的测定
趋势分析
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污

第3章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定

第3章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定

（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2 操作步骤
(2)标准回归方程的测定。分别称取0.050 0～0.120 0g待测定谷物样品20--30个(也 可用蛋白质含量差异大的样品30个左 右)，先用开氏法测出具蛋白质的含量， 然后按上法显色并测定吸收值A，作出标 准回归方程。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 3 备注
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2. 方法特点及应用范围
本法须用开氏法作标准回归方程。本法灵 敏度较低但经试验其与开氏法的相关性较 好，操作简单快速，适用样品广泛，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本 法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品测定，尤适用于大批品种选择用。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 2 操作步骤 （2）氮的测定。用移液管吸取澄清待测液5.00或 10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空 白试验。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 3 说明
（1）本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测 定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂 碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200g·L-1 - 250g·L-1单 宁或100g·L-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶 液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋 白质的换算系数即可得：“纯蛋白质”量。
该法为美国谷物化学协会(AACC)测定谷物蛋白质的正式 方法，且已有据此法原理为基础的快速测定蛋白质的自动 分析仪。 一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶 液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会 浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而 异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。 本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室 温20-25℃，须于120～190min内比色；40℃为15-70min显 色稳定；而在60℃连续振荡条件下显色，则反应时间缩短 为5min。 离心须用6 000r·min-1，10min可得澄清液，小于4000r·min-1 的效果不佳。

蛋白质与氨基酸测定

蛋白质与氨基酸测定
非必需氨基酸
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。

食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定

食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定

反应原理
电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。 在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变 化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过 消耗滴定剂的量来计算。
反应原理
因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定 突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试 样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定， 氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。
食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总 量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮即氨基酸态氮的百分率来表示。
氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指 标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。
与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸 的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。
.
营养学分类
（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸 人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足 正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需 氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。 （3）非必需氨基酸 指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨 基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
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.
化学结构分类
仪器及试剂
仪器及试剂
1.仪器 分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等； 2.试剂 （1）20g/L茚三酮溶液 称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使 其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色 瓶中冷暗处过夜，加水至58.04 磷酸盐缓冲溶液 准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为 pH8.04磷酸盐缓冲溶液。

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)
苋菜红 胭脂红 柠檬黄 日落黄 靛蓝 亮蓝
2．合成色素的提取
聚酰胺吸附色素
3．定性分析 14． 定量分析 5 ．薄层层析法、高效液相色谱法测定的基本要 求
三、甜味剂的测定
糖精钠的测定：糖精是应用较为广泛的人工甜味 剂 其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：
1．HPLC法 2．酚磺酞比色法 [原理] 样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提 取分离后，与酚和硫酸在175 ℃作用，生成酚 磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标 准系列比较定量。 [说明] ①本法受温度影响较大，要使糖精充分与 酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在 175士2℃温度下反应 2小时。②苯甲酸等有机 物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱 以排除干扰。 3． 紫外分光光度法
二、蛋白质和氨基酸的分类
三、蛋白质的一般性质
1． 物理性质
2 ．化学性质
第二节 蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质 的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质 含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、 酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含 量 。 具体测定方法：凯氏定氮法是最常用的，国内 外应用普遍；双缩脲反应、染料结合反应、酚 试剂法； 国外：红外分析仪
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大 量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时 应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛 醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制 热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继 续加热消化。 ⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克 试样5 m1的比例增加硫酸用量。
[步骤] 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与 滴 定 1.消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4= （NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O

蛋白质和氨基酸测定方法

蛋白质和氨基酸测定方法

第十章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料。

一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。

人体内的酸、碱及水分平衡，遗传信息的传递，物质代谢及转运都与蛋白质有关。

人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。

蛋白质在食品中含量的变化范围很宽。

动物来源和豆类食品是优良的蛋白质资源。

部分种类食品的蛋白质含量见表10-1表10-1 部分食品的蛋白质含量蛋白质是复杂的含氮有机化合物，摩尔质量大，大部分高达数万～数百万，分子的长轴则长达1nm ～100nm ，它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C 、H 、O 、N ，在某些蛋白质中还含有微量的P 、Cu 、Fe 、I 等元素，但含氮则是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。

一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系食 品 种 类 蛋白质的质量分数（以湿基计）/% 食 品 种 类 蛋白质的质量分数（以湿基计）/%谷类和面食大米（糙米、长粒、生） 7.9大米（白米、长粒、生、强化） 7.1小麦粉（整粒） 13.7玉米粉（整粒、黄色） 6.9意大利面条（干、强化） 12.8玉米淀粉 0.3乳制品牛乳（全脂、液体） 3.3牛乳（脱脂、干） 36.2切达干酪 24.9酸奶（普通的、低脂） 5.3水果和蔬菜苹果（生、带皮） 0.2芦笋（生） 2.3草莓（生） 0.6莴苣（冰、生） 1.0土豆（整粒、肉和皮） 2.1 豆类 大豆（成熟的种子、生） 36.5 豆（腰子状、所有品种、 23.6 成熟的种子、生） 豆腐（生、坚硬） 15.6 豆腐（生、普通） 8.1 肉、家禽、鱼 牛肉（颈肉、烤前腿） 18.5 牛肉（腌制、干牛肉） 29.1 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、 23.1 生） 火腿（切片、普通的） 17.6 鸡蛋（生、全蛋） 12.5 鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.9 鱼（金枪鱼、白色、罐 26.5 装、油浸、滴干的固体）数。

检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论

蛋白质中氨‎基酸的含量‎测定组成蛋白质‎的基本单位‎是氨基酸，氨基酸通过‎脱水缩合形‎成肽链。

蛋白质是由‎一条或多条‎多肽链组成‎的生物大分‎子，其含量测定‎是生化药品‎研究中最常‎用、最基本的分‎析方法之一‎。

目前其常用‎的测定方法‎有凯氏定氮‎法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马斯亮蓝‎法、紫外分光光‎度法及荧光‎法。

1凯氏定氮‎法1．1方法本法系‎依据蛋白质‎为含氮的有‎机化合物，当与硫酸和‎硫酸铜、硫酸钾一同‎加热消化时‎使蛋白质分‎解，分解的氨与‎硫酸结合生‎成硫酸铵。

然后碱化蒸‎馏使氨游离‎，用硼酸液吸‎收后以硫酸‎滴定液滴定‎，根据酸的消‎耗量乘以氮‎转化为蛋白‎质的换算系‎数，即为蛋白质‎的含量。

本法各国药‎典收载的方‎法一致。

故参照《中国药典》2005年‎版三部[41附录方‎法，按纯蛋白类‎供试品及添‎加无机含氮‎物质及有机‎非蛋白质含‎氮物质的供‎试品分别拟‎定各测定方‎法。

1．2讨论1．2．1凯氏定氮法‎虽耗时较长‎，但它是蛋白‎质测定方法‎中最经典的‎测定方法，本法所测的‎结果为蛋白‎质绝对浓度‎而非相对浓‎度，可用于标准‎蛋白质含量‎的准确测定‎。

1．2．2本法灵敏度‎较低，适用于O．2～2．o mg氮的测‎定，干扰少。

1．2．3蛋白质是复‎杂的含氮有‎机化合物，一般蛋白质‎的含氮量为‎16％，故含氮量转‎化为蛋白质‎的系数为6‎．25。

但由于不同‎蛋白质的结‎构差异，其换算系数‎会稍有区别‎，如乳制品为‎6．38，动物胶为5‎。

65等，因此一些特‎殊蛋白质应‎在各论中相‎应说吩其转‎化系数。

1．2．4在本法附注‎中起草了非‎蛋白氮供试‎品溶液制备‎的两种常用‎方法用于非‎氮的测定，一般采用钨‎酸沉淀法，但当供试品‎中含有氨基‎酸(精氨酸)时，由于其会影‎响蛋白质的‎沉淀，故建议采用‎三氯醋酸沉‎淀法方法(1)与方法(3)的线性相关‎系数均能达‎到0．999以上‎，较理想；方法(1)试剂配制繁‎琐且整个实‎验费时长，而方法(3)操作更简便‎快速。

第九章 蛋白质和氨基酸的测定


4．结果计算
式中
w——氨基酸态氮的质量分数；
C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
V1——用中性红作指示剂滴定消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，ml；
V2——用百里酚酞作指示剂滴定消耗氢氧化钠 标准溶液的体积，ml； 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
m—— 测定用样品溶液相当于样品的质量，g。
思考题：
1．为什么说用凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质含量 为粗蛋白含量?
2．在消化过程中加入的硫酸铜试剂有哪些作用?
3．样品消化过程中内容物的颜色发生什么变化?为什 么?
4．样品经消化进行蒸馏之前为什么要加入氢氧化钠？ 这时溶液的颜色会发生什么变化?为什么?如果没有变 化，说明了什么问题?须采取什么措施？ 5．蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要用硫 酸调成酸性? 6．蛋白质测定的结果计算为什么要乘上蛋白质系数?
(5) 混合指示剂
甲基红—溴甲酚绿混合指示剂： 5份2g/L溴甲酚绿95％乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙 醇溶液混合均匀。终点为灰红色。 或甲基红—亚甲蓝混合指示剂：
一体积的亚甲蓝（0.05%酒精溶液）和二体积的甲 基红指示剂（0.05%酒精溶液）的混合物。终点为紫色。
(6) 饱和硼酸溶液（40g/L）： 称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。 (7) 0.1N盐酸标准溶液
第九章 蛋白质和氨基酸的测定
第一节 概述 第二节 蛋白质的测定方法 第三节 氨基酸态氮的测定
第一节 概述
一、pro组成与蛋白质系数 1．组成 pro是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大 分子化合物。
元素组成百分比：
元素 C H O N S P
百分比 50 7 23
16

第2章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定

第二章 蛋白质和主要必需 氨基酸的测定
第一节 概述

蛋白质是植物的重要组成成分，也是农产品品质中最重 要的成分。

它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有
变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，其中以籽 粒中最多，如豆类可达45％-55％，其次是花、叶、茎和 根。

作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组

赖氨酸是一种必须的氨基酸。缺乏赖氨酸，人与动物不仅不能正常
发育，还会引起某些疾病。在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的 氨基酸，被称为第一限制氨基酸。


对人体的作用：
1．提高智力、促进生长、增强体质。 2．增进食欲、改善营养不良状况。 3．改善失眠，提高记忆力。 4．帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。
较慢，试剂费用较高。

近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自
动的开氏定氮仪。

瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的kjel-Auto自动氮和 蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的Kjel—FOSS自 动蛋白质分析仪等。
二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色（570nm）后的氨基酸由光度计 检测。
氨基酸自动分析仪
操作步骤

(1) 全氨基酸试样的制备（盐酸水解）。 (2) 胱氨酸及色氨酸的水解（盐酸分解过程
中破坏，需另行制备）。

(3) 植物性产品中游离氨基酸试样的制备。 (4) 上机测定。
二、谷物和饲料中赖氨酸的测定 ——染料结合法-DBL法

0.01 mol· -1(1/2H2SO4)或0.02 mol· -1 HCl标准溶液。 L L 其他试剂同第四章(土壤全氮的测定)。

食品理化检验分析 第九章 蛋白质和氨基酸的测定

4.用HCL滴定
二、 自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
5.计算： 氨基酸态氮=〔 c×（V2-V1）×0.014×100 ） 〕/W×100 V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗 的体积 V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液 消耗量
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。
（二）茚三酮的比色法
原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生 成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm）
一.双缩脲法 1.原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时 ，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和 物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键（ —CO—NH—），与双缩 脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定 条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分 光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
3．双指示剂：
① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.4～10.6）
③ 0.1%中性红 50%乙醇溶液，（6.8～8.0） ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：
取相同两份样品20～30mg→分别于250ml三角瓶→各 加50ml蒸馏水 一份加中性红3滴→用0.1mol/L NaOH 滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚 酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1mol/L NaOH 滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液ml数。
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? 三、滴定
将上述吸收液用 0.1000mol/L 盐酸标准液直接滴 定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液 用量，同时作一试剂空白，记录空白试验消耗盐 酸标准液的体积。
结果计算：
?
微量凯氏定氮法
1.原理：同常量凯式定量法 2.仪器：微量凯氏定氮法装置 3.试剂：a,b,c,d,e,f（同常量凯氏定氮法）
醇溶液均匀混合 ? 6、40%NaOH溶液 ? 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液
测定
一、消化：
? 1、称量：准确称取固体样品1.00~3.00g（视样品含氮量多 少而定）或吸取液体样品10.0~20.0mL
? 2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中， 加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心）， 轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其 倾斜放置于放有石棉网的电炉上。
g.0.01000mol/L盐酸标准溶液 4.测定：a.消化（步骤同常量法）
定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
C.吸收
3.氧化剂
? 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。
? 常用的有：高氯酸，过氧化氢
仪器
A、凯氏烧瓶
规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml
特点：瓶颈长、耐高温
B 、 常 量 凯 氏 定 氮 装 置
试剂
? 1、浓硫酸 ? 2、硫酸铜 ? 3、硫酸钾 ? 4、4%硼酸溶液 ? 5、甲基红---溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液
? 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。 按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。
1.增温剂
? 当温度低于 360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮 化物，会导致分析结果偏低。当温度高于 410 °C时， 铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。
蛋白质及氨基酸的测定
生物技术第三组
? 蛋白质存在于一切生物的原生质中，是构
成生物体细胞组织的重要成分，是生命的物 质基础。凡是有生命的物体，无论是动植物 还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营养 代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生 物就不能维持生命。人及动物只能从食物中 得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋 白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是食品中重要的营养成分。
? 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液， 并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约 30min
? 3、吸收：硼酸溶液吸收氨后，颜色由淡红色逐渐变成蓝绿色， 收集吸收瓶中馏出液体积约250mL左右
? 4、蒸馏完毕：将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口， 继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以纳氏试剂或红色 石蕊试剂检查氨是否蒸馏完毕。如无氨生成，即可停止加热。
? 蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子 化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、 氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还 含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮 则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。
? 测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可 分为间接方法和直接方法。
? 间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量， 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量
? 直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直 接测定蛋白质含量的方法。
? 测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是 测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之 一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、 考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋 白质含量测定。
蛋白质的测定方法：
? 凯氏定氮法 ? 双缩染料比色法
? 3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲 到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失， 升高温度（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后， 再继续加热微沸30min。
? 4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻 璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
? 二、蒸馏
? 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼酸 溶液及指示剂2~3滴）
? 纯硫酸的沸点是 340 °C附近，因其温度达不到最适， 则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾，硫 酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水 分不断逸出使硫酸浓度增大。
? 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的 铵盐分解释放出氨而造成损失。
2.催化剂
? 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
半微量凯氏定氮法 自动定氮仪法
常量凯氏定氮法
? 适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量 的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准 分析方法。
? 一 原理：
? 有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨， 再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将 氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴
凯氏定氮法
? 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。
? 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定 总有机氮最准确和操作简单的方法之一。
? 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后 乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量， 由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物， 因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。
常量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法