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石蜡切片免疫组化套染 PAS 应用于肾活检组织病理诊断中的准确性探讨发布时间：2021-10-29T08:18:35.217Z 来源：《医师在线》2021年25期作者：陈忠生[导读] 目的研究石蜡切片免疫组化套染PAS应用于肾活检组织病理诊断中的准确性陈忠生成都高新达安医学检验所四川省成都市 611731摘要目的研究石蜡切片免疫组化套染PAS应用于肾活检组织病理诊断中的准确性。
方法纳入我院2020年1月~2021年1月期间收治的45例肾病患者。
结果膜性肾病组织免疫荧光染色显示翠绿色颗粒状荧光沿肾小球毛细血管壁分布，电镜下见肾小球毛细血管基膜外上皮下团块状电子致密物沉积。
IgA肾病组织显示肾小球系膜区团块状或鹿角状绿色荧光，电镜下见系膜区团块状电子致密物沉积。
在采取石蜡切片免疫组化套染PAS诊断时，阳性符合率较高。
结论肾活检组织病理诊断中采取石蜡切片免疫组化套染PAS时，准确性较高，值得推广。
关键词石蜡切片免疫组化套染PAS；肾活检；病理诊断在肾活检组织病理诊断中主要选择的方式为冷冻切片免疫荧光染色石蜡切片、PAS染色、HE染色等，随着当前诊断水平不断提高，为了进一步得到更加准确的病理结果，检测的方式也呈现出多种多样性[1]。
考虑到肾穿刺作为一种有创性操作，再加上操作时十分考验检测者的个人技术，同时患者的个人差异也会对诊断结果造成一定影响，所以结果往往不尽人意；另外对于很多基层医疗单位而言，无法购买专业设备，因此导致这一诊断无法顺利开展。
对此，为了探索新的诊断方式，以最大程度获取疾病信息，本文着重对石蜡切片免疫组化套染PAS展开深入研究，分析其应用效果，现报告如下。
1资料与方法1.1一般资料2020年1月~2021年1月，纳入我院收治的45例肾病患者，其中IgA肾病患者26例，膜性肾病19例，对诊断结果进行回顾性分析。
1.2方法首先将石蜡切片二甲苯脱蜡2次，每次20min，再用80%-100%梯度乙醇脱水，每次5min。
石蜡包埋组织免疫荧光染色的技术改进发表时间：2013-04-11T14:06:13.500Z 来源：《医药前沿》2013年第4期供稿作者：陈琼霞陈莹黄萱刘丽江[导读] 石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术，在基础研究以及临床病理诊断中仍发挥着重要的作用。
陈琼霞1 陈莹1 黄萱2 刘丽江2（通讯作者）（1江大病理诊断所技术部湖北武汉 430056）（2江大病理诊断所组织病理诊断部湖北武汉 430056）【摘要】目的探讨抗原修复方法在石蜡包埋组织免疫荧光染色中的应用。
方法石蜡切片经0.2%Triton X-100和0.5%Triton X-100梯度去垢剂（细胞表面活化剂）处理后，进行免疫荧光染色。
结果免疫荧光染色结果定位明确，无扩散效应和非特异性着色。
其染色强度接近石蜡包埋切片的免疫组化染色效果。
结论低浓度梯度去垢剂Triton X-100进行抗原修复，技术方法简单可行。
【关键词】免疫荧光染色抗原修复【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）04-0368-02 石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术，在基础研究以及临床病理诊断中仍发挥着重要的作用。
尤其是在多重标记物的定位、膜抗原的鉴定、抗体的类型（荧光标记抗体）、微量蛋白质的定位以及肾穿刺组织活检的病理诊断中具有非常重要的地位。
但是，组织经过福尔马林固定后，在固定的过程中Ca2+和其他二价离子与蛋白质所形成的紧密复合物，封闭了抗原，导致在石蜡切片上进行免疫荧光染色时，抗原抗体的结合受阻，直接影响染色结果的特异性和敏感性[1]。
在临床的实际工作中，常常又会遇到只有石蜡包埋的材料，而又必须进行免疫标记的情况。
如：肾穿刺活检组织冰冻切片中没有肾小球，不得不在石蜡包埋组织中解决诊断的问题等等[2-3]。
因此，在技术上解决石蜡包埋组织的免疫荧光染色问题，具有非常重要的临床应用价值。
我们采用去垢剂修复抗原法对石蜡切片进行抗原修复后，再行免疫荧光染色，取得了比较好的效果。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。
通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。
本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。
第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。
可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。
固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。
固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。
第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。
脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。
浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。
一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。
第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。
将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。
固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。
切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。
第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。
一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。
重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。
根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。
第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。
孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。
抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。
第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。
想做多重免疫荧光？收好指南，教你一张片子染出七种颜色想做多重免疫荧光？需要先思考这几个问题：问题1：你认得全动物园里的动物们吗，比如大鼠，小鼠，兔，山羊，绵羊，鸡，荷兰猪（豚鼠）？不同种属的抗体需闹清楚。
问题2：你确定能分得清字母表并做得了十以内得加减法吗？有不同亚型鉴定的过的一抗，比如：IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgM，IgE 不知道怎能行？问题3：你确定能将动物和数字字母们对号入座，并找对门牌吗？有对应种属特异反应性的Fab 二抗，比如：F(ab')2 Fragment （避免Fc 反应性出现的非特异染色），Cross adsorbed（抗体纯化过程交叉吸附，避免物种交叉反应带来的背景）。
问题4：你确定能将重峦叠嶂移出两山排闼吗？选择合适的荧光素，明辨激发光和发射光，且不会导致荧光背景增强，比如：FITC、PE、Cy、Alexa Fluor、DyLight。
就算上面的问题你都能搞定，订购来了各种试剂，准备来了片子，你就一定能染出来多重颜色？你只是迈开了万里长征的第一步而已。
因为要得到理想的荧光实验结果，每一个步骤都需深(w ā) 度(kēng) 优(mái) 化(tǔ)，固定通透方法、浓度配比、抗体共孵育、抗体稀释液、封闭条件等等。
此时，有人在你发际线还没有升高，头发还乌黑浓密的时候，在你的耳边悄悄跟你说：做多重荧光简单，有种快捷省时的方法。
先让你们随意感受一下这种方法染出来的图片：接下来我们将仔细介绍该方法实验原理和实验步骤。
多重荧光免疫组化（mIHC）实验原理上述方法采用TSA 技术(Tyramide Signal Amplification?，酪胺信号放大技术)：简单来说，用该方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。
荧光素在HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
石蜡切片免疫荧光染色方法GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
多重免疫荧光染色技术（multiple immunofluo⁃rescence staining ）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
其主要原理是利用抗原抗体反应的特异性，在染色过程中同时采用不同颜色荧光素配伍标记的二抗，从而达到在同一样品中观察不同抗原的表达及分布，进而研究目标蛋白的定位及表达情况［1］。
近年来随着荧光染料的不断开发完善及激光共聚焦荧光显收稿日期：2018-06-13基金项目：广东省肾脏病重点实验室基金（214B030301023）；广东省医学科学基金（A2018042）作者简介：范瑾瑾，副主任技师，研究方向：肾病发病机制，E-mail ：fanjinj@ ；毛海萍，通信作者，教授，博士生导师，E-mail ：haipingmao@石蜡切片多重免疫荧光染色优化条件探讨范瑾瑾，骆宁，彭文兴，毛海萍（中山大学附属第一医院肾内科，广东广州510080）摘要：【目的】探讨在石蜡切片上不同染色条件对多重荧光标记结果的影响。
【方法】根据不同组织抗原选择合适的固定剂；对石蜡组织切片采用高温高压的抗原修复方式，使用柠檬酸盐缓冲液或EDTA 抗原修复液进行抗原修复，并在染色操作过程中增加封闭步骤，随后进行常规组织免疫荧光染色。
【结果】常规石蜡切片用40g/L 多聚甲醛固定、抗原糖基含量高的石蜡切片用过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定可以很好的保护切片中的抗原；pH 6.0的枸橼酸缓冲液及pH 8.0的EDTA-Na 缓冲液分别对组织胞浆抗原及胞核抗原具有较好的抗原修复作用；多重荧光染色不同种属来源第一抗体染色间增加一次封闭步骤，可有效的改善多重荧光染色质量。
【结论】选择合适的固定剂、抗原修复液及增加抗原封闭次数对石蜡组织切片上的多重荧光标记结果具有显著的影响。
关键词：多重免疫荧光染色；石蜡切片；优化条件中图分类号：R331文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2018）05-0675-07Discussion of Multiple Immunofluorescence Staining Optimized Conditions onParaffin SectionFAN Jin-jin ，LUO Ning ，PENG Wen-xing ，MAO Hai-ping（Department of Nephrology ，The First Affiliated Hospital ，Sun Yat-sen University ，Guangzhou 510080，China ）Corresponding to ：MAO Hai-ping ，E-mail ：haipingmao@Abstract ：【Objective 】To investigate the effect of different multiple immunostaining condition on tissue paraffinsection.【Methods 】Tissue paraffin sections were treated with different fixing agents according to thediverse tissue antigens.The tissue antigens were retrieved with citrate buffer or EDTA-Na buffer by using high temperature and high pressure antigen retriever.Additional blocking processing was performed following by the conventional tissue immunofluorescencestaining.【Results 】The citrate buffer （pH 6.0）was suited for cytoplasm antigens retrieve ，nevertheless the EDTA-Nabuffer （pH 8.0）was fitted fornuclear antigens.For the multiple immunofluorescence staining ，additional block processing between the various species first antibodies staining can significant improve the staining results.【Conclusions 】Suitablefixing agent ，matched antigen retrieve buffer and additional blocking process were critical for getting perfect results in multiple immunofluorescence staining on tissue paraffin section.Key words ：multiple immunofluorescence staining ；paraffin section ；optimized conditions［J SUN Yat⁃sen Univ （Med Sci ），2018，39（5）：675-681］第39卷第5期2018年9月中山大学学报（医学版）JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY （MEDICAL SCIENCES ）Vol.39No.5September2018中山大学学报（医学版）第39卷微镜的广泛使用，多重免疫荧光染色技术已经越来越广泛地运用于科学研究中。
有文献报道用荧光标记同一细胞不同细胞器的荧光染料可达7种，这成为分子生物学研究不可或缺的实验手段［2］。
然而，由于多重荧光标记操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像免疫印迹那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除需要高质量的抗体外，还必须设立严谨的实验对照，以及对实验条件进行反复优化［3］。
常规的多重免疫荧光实验包括样品处理、固定、封闭、抗体孵育以及最后的封片、观察。
优化免疫荧光染色的实验条件、规范实验操作步骤是保证免疫荧光实验结果准确、可靠的关键［4］。
本文探讨了在组织多重免疫荧光染色操作过程中，不同类型的固定剂、抗原修复液的不同pH值以及对不同种属来源的第一抗体染色过程中增加封闭步骤等实验条件对多重免疫荧光结果的影响，以明确在组织切片上实现多重荧光标记的优化实验条件。
1材料与方法1.1材料1.1.1组织标本及处理方法腹膜组织标本来源于本实验室大鼠腹膜炎模型的脏层腹膜组织［5］；肾组织标本来源本实验室大鼠UUO模型7d的肾脏组织［6］，均已证实模型成功。
每一模型6只大鼠。
固定后，常规脱水，石蜡包埋成石蜡包块。
每一组织连续切片5张，切片厚6μm，置于多聚氨基赖氨酸预处理的玻片上，37℃8h烤干。
1.1.2主要试剂和仪器40g/L多聚甲醛固定液（Paraformaldehyde，PFA）购自博士德生物公司、过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-Paraformaldehyde，PLP，配制见方法）。
抗原修复液A液（pH6.0的枸橼酸盐缓冲液Cat# 62706-10）、抗原修复液B液（pH8.0的EDTA-Na 缓冲液Cat#62706-11）均购自EM Science公司。
BSA购自Sigma公司，正常驴血清（normal donkey serum）购自Jackson Lab（美国）。
一抗：兔抗Aqp1多克隆抗体（Cat#ab15080）、兔抗KI67单克隆抗体（Cat#ab16667）、兔抗P-STAT3单克隆抗体（Cat#ab 32143）、小鼠抗CD68单克隆抗体（Cat#ab955）、兔抗CD206多克隆抗体（Cat#ab64693）购自Abcam公司；小鼠抗Col1单克隆抗体（Cat#1310-01）购自Southern Biotect公司；兔抗p62多克隆抗体（Cat#CTX100685）和小鼠抗α-SMA单克隆抗体（Cat#GMO85129）购自GeneTex公司；小鼠抗HSP72多克隆抗体（Cat#ADI-SPA-8131-D）购自Stressgen Biotechnologies公司；兔抗PH3多克隆抗体（Cat#H0412）及兔抗FSP（Cat#H027550）多克隆抗体购Sigma公司；兔抗P-SMAD2/3（Cat#14141）购自Cell Signaling Technology公司。
二抗：Alexa⁃Fluor488驴抗小鼠IgG抗体（Cat#R37118）和驴抗兔IgG抗体（Cat#A21202）、AlexaFluor546驴抗小鼠IgG抗体（Cat#A10036）和驴抗兔IgG抗体（Cat#A10040）、AlexaFluor647驴抗兔IgG抗体（Cat#A31573）以及DAPI均购自Life公司。
抗原修复锅Aptum Antigen Retriever来自EM Science公司（美国）。
激光共聚焦荧光显微镜Zeiss510Meta 来自Carl Zeiss公司（德国）。
1.2方法1.2.1PLP固定液配制①PLP储存液A（0.1mol/L 赖氨酸，0.5mol/L Na3PO4，pH7.4）：称取赖氨酸盐1.827g溶于50mL蒸馏水中，得到0.2mol/L的赖氨酸盐缓冲液，然后加入Na2PHO4至0.2mol/L，将pH值调至7.4，补足0.1mol/L的PBS至100mL，赖氨酸终浓度为0.1mol/L，4℃冰箱保存，2周内使用。
②PLP储存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100mL蒸馏水中，配成8%多聚甲醛溶液。
过滤后4℃冰箱保存。
PLP固定液由3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），NaIO4终浓度为2%［7］。
1.2.2固定方法大鼠UUO模型7d的肾脏组织，标本放入4%PFA固定液中，常温固定，8h；大鼠腹膜炎模型的脏层腹膜组织，标本分两份，一份放入4%PFA固定液中，另一份放入PLP固定液里，常温固定8h。
常规脱水，石蜡包埋。
1.2.3高温高压抗原修复方法将水化后的石蜡玻片置于分别含有0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（A 液）及0.01mol/L EDTA-Na缓冲液（B液）的抗原修复液玻片盒，置于抗原修复锅内，启动仪器，高温高压15min，自然冷却过夜。
