实验十微生物稀释平板计数、划线分离

实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。

2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。

二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。

在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。

三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。

2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。

3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。

四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。

具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。

（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。

（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。

然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。

环境中微生物的检测和分离纯化一、实验目的：1.熟悉常用微生物培养基的配制方法。

2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。

3.用平板划线法和稀释法分离微生物。

4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。

二、实验原理：（一）微生物的分离与纯化：土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此，土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离和纯化。

常用的是平板分离法。

为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。

再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌种。

（二）平板菌落计数法：平板菌落计数法是将样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。

此法缺陷：操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响。

此法优点：可以获得活菌的信息，被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。

三、实验材料和仪器：土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水。

取液器（5000ul、1000ul各一支），培养箱，培养皿（20个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5000ul、1000ul无菌吸头，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。

四、实验步骤：（一）培养基的制备（第二次实验时准备）：肉汤蛋白胨培养基：牛肉膏2g蛋白胨4gNaCl 2g蒸馏水400mL琼脂8g1. 称量：按上述配方称量各类物质。

分区划线分离法实验报告菌种的分离纯化技术——平板划线法实验目的了解平板划线分离纯种的原理，并熟练掌握该操作法。

实验内容1．培养基平板的制备。

2．用平板划线分离法分离混菌。

实验原理平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。

为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。

实验器材大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液牛肉膏蛋白胨培养基无菌培养皿，水浴锅，接种环等。

实验步骤1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。

2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。

如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。

左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。

各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。

常用的几种微生物接种方法接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。

接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。

在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。

不同培养基，接种方法也不同，分述如下：一、平板划线接种法（分离培养法）是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。

平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。

（一）分段划线法平板分段划线(左)及培养后菌落分布图本法多用于含菌量较多的标本。

方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。

这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。

（二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。

方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。

二、斜面接种法此法主要用于移种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。

通常是从平板培养物上挑取某一单独菌落或者从一支已长好的斜面菌种，移种至斜面培养基上，接种步骤如下（以从已长好的斜面菌种转接为例）：（一）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。

微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数关键词：微生物分离纯化计数实验原理稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。

计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。

经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。

一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。

为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。

土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。

其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。

本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。

分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。

分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。

在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。

第1篇一、实验目的1. 熟悉微生物纯系分离及保藏的基本原理和方法。

2. 掌握平板划线法分离纯化微生物的操作技能。

3. 学习定期移植法进行微生物保藏。

4. 了解微生物菌落特征，并能对分离纯化的微生物进行初步鉴定。

二、实验原理微生物纯系分离是指从混杂的微生物群体中分离出只含有一种微生物的过程。

常用的分离方法有稀释分离法和平板划线法。

稀释分离法是将待分离的微生物样品进行一系列的稀释，使每个稀释度中仅含有少数或单个微生物细胞，从而能够在培养基上形成单菌落。

平板划线法是在固体培养基表面用接种环划线，使微生物细胞逐渐分散，最终形成单菌落。

微生物保藏是防止微生物死亡和变异，保持其活力和特性的一种方法。

定期移植法是将分离纯化的微生物接种于新鲜培养基上，定期进行移植培养，以保持其纯度和活力。

三、实验器材1. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、营养琼脂培养基2. 器具：接种环、涂棒、酒精灯、无菌吸管、无菌镊子、无菌剪刀、无菌培养皿、无菌生理盐水、无菌水3. 试剂：无菌甘油、无菌琼脂糖4. 仪器：恒温培养箱、显微镜、电子天平四、实验步骤1. 配制培养基：按照实验要求，配制牛肉膏蛋白胨培养基和营养琼脂培养基，分装于无菌培养皿中，于120℃高压灭菌15分钟。

2. 稀释分离：取土壤样品10g，加入90ml无菌生理盐水中，充分振荡，制成10-1稀释液。

取1ml稀释液加入9ml无菌生理盐水中，制成10-2稀释液。

以此类推，制成10-3、10-4、10-5稀释液。

3. 平板划线分离：将牛肉膏蛋白胨培养基和营养琼脂培养基冷却至45-50℃，分别倒入无菌培养皿中，凝固后，用接种环在培养基表面划线。

重复划线，使微生物细胞逐渐分散。

4. 观察菌落特征：将培养皿置于恒温培养箱中，培养24-48小时，观察菌落特征，记录菌落大小、形状、颜色、边缘、表面等。

5. 鉴定菌落：对分离纯化的微生物进行初步鉴定，如显微镜观察、生化试验等。

6. 定期移植保藏：将分离纯化的微生物接种于新鲜培养基上，置于恒温培养箱中培养，每5-15天移植一次，以保持其纯度和活力。