基于NMR的代谢组学体液样品制谱技术综述

细胞代谢组学研究及应用进展【关键词】细胞代谢组学；研究方法与应用；综述【摘要】细胞代谢组学作为代谢组学研究的一个新兴的方向，在病原体感染、肿瘤研究、药物作用机制及药物研发、毒性评价等多个领域都有所应用。

可解决基本的生物学问题，并允许观察细胞内的代谢现象。

现简要综述细胞代谢组学的主要研究方法及其应用方面的研究进展。

1.细胞代谢组学的研究方法细胞代谢组学实验一般可分为几个步骤：细胞增生培养或刺激、淬灭、代谢物提取、样品检测和数据处理。

1.1细胞淬灭细胞淬灭是指快速使细胞内的酶失活，阻止代谢物变化。

理想的淬灭技术应在不损害细胞、不造成细胞内代谢物泄漏的前提下确保胞内酶迅速失活。

Hounoum等考察3种细胞淬灭方式对NSC-34鼠神经元细胞的影响，分别为-40℃甲醇淬灭、-20℃甲醇淬灭及迅速冻存于-80℃后加入4℃甲醇淬灭。

实验结果显示-40℃甲醇是用于该细胞最为理想的淬灭方式；有研究发现甲醇会破坏细胞膜结构，从而导致无法控制的细胞内代谢物泄漏，故常在甲醇中加入缓冲液如HEPES及AMBIC以维持离子强度，避免渗透冲击。

而对于贴壁细胞，液氮冷冻被是停止其酶活性的最佳方法，Zhao等比较了液氮和75%甲醇（-80℃)2种溶液对副溶血性弧菌细胞的淬灭效果，结果发现75%甲醇（-80℃）淬灭时，细胞发生代谢物泄漏；液氮淬灭速度快，且不存在代谢物泄漏问题。

1.2代谢物提取代谢物具有不同的化学和物理性质，如大小、质量、极性、溶解性等，而细胞代谢组学要求找到一种合适的提取方式，尽可能多地把胞内所有代谢物定量提取出来。

因此，提取方法应该有效而没有选择性和破坏性。

提取过程应有效地从细胞中释放代谢物，避免潜在干扰，确保最小代谢物损失。

胞内代谢物通常单独用有机溶剂，或与水结合，或与其他有机溶剂结合，在不同温度条件下提取。

经典的酸性和碱性提取剂也可分别用来提取对酸、碱稳定的化合物。

对于悬浮细胞，常用含水甲醇、含水乙腈或纯甲。

基于代谢组学的生物样品分析和鉴定随着生物科技的不断发展，基于代谢组学的生物样品分析和鉴定已经成为了许多领域的重要手段。

代谢组学是研究生物体内代谢产物（也称为代谢物）的组合及其与环境、生理及疾病等因素之间关系的科学，其研究对象包括生物体内的小分子有机物和无机物。

生物样品是代谢组学研究的主要对象，通常分为血液、尿液、唾液、组织、细胞等。

血液样品包括全血、血清、血浆等，在代谢组学研究中，血清和血浆是最常用的样品，因为它们可以反映出机体代谢的整体情况和代谢物浓度的变化。

尿液样品中含有丰富的代谢产物，尿液代谢组学研究已成为很多疾病的诊断和治疗的重要手段。

唾液样品中也含有很多代谢产物，比如蛋白质、碳水化合物、核酸、类固醇等，可以作为口腔健康状况的重要指标。

组织样品是代谢组学研究中比较重要的样品之一，可以揭示某些疾病的组织特异性代谢变化，识别新的代谢通路和相关的代谢物。

细胞样品是代谢组学中的另一个重要样品，可以研究单个细胞的代谢通路，探索细胞内代谢物与功能之间的关系。

在代谢组学研究中，样品的前处理对于后续的代谢分析和鉴定非常重要。

常用的前处理方法包括气相色谱质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱质谱联用技术（LC-MS）、核磁共振技术（NMR）等。

GC-MS技术可以对代谢物进行鉴定和定量分析，但是对于极性代谢物和高沸点物质的分析能力相对较弱。

LC-MS技术可以分析多种化学组分，包括高极性的小分子有机物和高分子有机物，但是需要考虑多种条件的优化，以保证分离效果和分析灵敏度。

NMR技术可以提供关于代谢物相对浓度、结构和分子动力学信息，是一种非破坏性的方法，但是样品制备要求高，且具有较低的探测灵敏度。

代谢组学研究还需要进行数据分析和生物信息学处理，以获得代谢物水平的信息。

数据处理流程主要包括初始数据预处理、化学特征提取、特征选择、建模方法的选择等。

常用的统计方法包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘回归（PLS）、变量重要性投影（VIP）、分类回归树（CART）等。

昆明小鼠常见体液与组织代谢组NMR分析蔡毅;豪富华;王玉兰【摘要】昆明小鼠是我国特有且广泛使用的模式动物.利用核磁共振(NMR)技术对昆明小鼠血液、尿液和肝脏等组织中的代谢物进行了较为系统的研究.通过对昆明小鼠体液和组织中代表性的1H NMR谱图,并结合COSY(Correlation Spectroscopy),TOCSY(Total Correlation Spectroscopy),J-Res(J-Resolved Spectroscopy),HSQC(Heteronuclear Single QuantumCoherence),HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence)等2D NMR谱图进行分析,共解析出82种小分子代谢物,其中尿液中约有46种,血样中约有32种,肝脏提取物中约有43种,肾脏皮质提取物中约有39种,部分代谢物在不同样品均存在.这为进一步利用昆明小鼠为动物模型的研究提供了基础信息.%Kunming (KM) mouse is a widely used model animal species in China. We measured the metabolites in plasma, urine, liver and other tissues from KM mice with nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabonomic analysis. The representative 1 H NMR spectra of biofluids and tissues from KM mice were assigned with the aid of a range of two-dimensional NMR techniques, including COSY (Correlation Spectrosco-py), TOCSY (Total Correlation Spectroscopy), J-Res (J-Resolved Spectroscopy), HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) and HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence). A total of 82 different metabolites, including 46 metabolites from the urine, 32 from the plasma, 43 from the liver extracts and 39 from the kidney cortex extracts, were identified. It was found that somemetabolites existed in all the samples. Our results provide a foundation for future metabonomic studies using KM mice as the model animal.【期刊名称】《波谱学杂志》【年(卷),期】2013(030)001【总页数】14页(P55-68)【关键词】核磁共振(NMR);昆明小鼠;体液;代谢组【作者】蔡毅;豪富华;王玉兰【作者单位】波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉430071【正文语种】中文【中图分类】O482.53引言昆明小鼠(Chinese Kunming Mice， KM)是我国特有的小鼠品种，且具有繁殖率和成活率高，抗病力和适应性强等优点，因此，它作为模式动物被广泛应用于生物医学[1,2]、毒理学[3]、病理学[4]、生理学[5]、营养学[6]、细胞学[7]、遗传学[8]等诸多研究领域. 昆明小鼠的基因组、转录组、蛋白组等方面已开展了不同层次的研究，但对代谢组目前还缺少比较系统和完整的分析. 代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学等之后发展起来一门学科，通过检测代谢物水平的整体和动态变化，可以推测对应的蛋白质组等的变化，构筑代谢网络调控图. 对生物体生理和病理状态的代谢组分析可以了解机体的生理病理状况[9,10].代谢组分析作为代谢组学研究中的最关键的部分，对于正确判断机体发生的变化至关重要. 目前代谢组分析的方法主要为借助于核磁共振(NMR)、质谱、色谱等分析化学的谱学方法进行代谢物整体水平的检测. 使用NMR法进行代谢组学分析有诸多优点， NMR法有良好的稳定性、客观性和重复性，可以得到定量信息；对于样品不需要过于复杂的前处理，有时甚至不需要前处理，这样可以保证样品的完整性，并且可以在更接近样品本身生理条件下进行检测，即能够更完整的检测出样品中的生物信息. 但是， NMR法也有一定的缺点，检测灵敏度相对较低，仪器价格较贵. 但是即便如此，基于NMR法检测的代谢组学仍然广泛应用于疾病生理、药物开发、生物医学、营养学、植物药学、环境科学等诸多领域，因此它被应用于本文的研究中.由于生物样品的复杂性，因此解析代谢物结构是基于NMR的代谢组分析一个重要环节. 本文通过对昆明小鼠体液和组织中代表性的 1H NMR谱图并结合二维J分解谱(J-Resolved Spectroscopy， J-Res)[11]、 1H-1H同核相关谱(Correlation Spectroscopy， COSY)[12]、 1H-1H同核质子全相关谱(Total Correlation Spectroscopy， TOCSY)[13]、 1H-13C异核单量子相关谱(Heteronuclear Single Quantum Coherence， HSQC)[14]和 1H-13C异核多键相关谱(Heteronuclear Multiple Bond Coherence， HMBC)[15]对代谢物进行了分析和鉴定. 通过本研究，我们期望为昆明小鼠在其它方面的研究工作提供一定的基础信息.1 材料和方法1.1 实验材料无特定病原体(Specific Pathogen Free， SPF)级昆明小鼠由湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供，共计100只(雌性、雄性各50只， 4周龄，均已断奶)，实验动物合格证编号 SCXK(鄂)2003-2005 No.00000463；饲养于中国科学院武汉病毒研究所动物实验中心，实验动物设施使用证明编号SYXK(鄂)2005-0034 No.00000532. 动物随机分笼饲养，并随机编号雌性F1～50，雄性M1～50，自由饮食饮水，饲养环境温度20～25 ℃，湿度50%～70%，每12小时(h)昼夜交替一次. 在适应2周后，即从6周龄时开始收取尿样，盛放在干净EP管中后液氮速冻保存. 收取样品的时间点为从6～71周龄每隔4周收取样品1次. 另外，在第8， 26， 51， 71周每次分别处死雌雄昆明小鼠各1/4的数量，取血浆和组织液氮速冻后都置于-80℃冰箱保存.处死时使用摘眼球取血法，将血液置于含有15 μL 20%肝素钠溶液的EP管中混匀，在25 ℃下以17 444 m/s2离心10 min，取上清置于新的EP管中用液氮速冻保存. 摘取肝、肾等组织后分别用锡纸包装，液氮速冻保存. 其中肾脏分肾皮质以及髓质分别包装保存. 以上所有样品在液氮速冻后都置于-80 ℃冰箱，用于NMR检测.1.2 实验方法1.2.1 样品配制尿样：150 μL尿样与400 μL 30%的D2O，55 μL尿样缓冲溶液(1.5 mol/L，K2HPO4∶NaH2PO4=4∶1， 0.05% TSP-d4， 100% D2O配置， pH 7.4)混匀，在4 ℃， 109 564 m/s2下离心10 min，取上清550 μL置于直径5 mm NMR管中.血浆：35 μL血浆与35 μL血浆缓冲溶液(45 mmol/L，K2HPO4∶NaH2PO4=4∶1， 0.9% NaCl， 20% D2O配置， pH 7.4)混匀后，取60 μL置于直径1.7 mm NMR管中，外套直径5 mm NMR套管.组织提取：使用天平称取肝脏60 mg，肾皮质30 mg左右，均取内脏组织的同一部位，分别放置于2 mL的EP管中，加入1 mL 体积浓度为66.7%甲醇溶液以及一颗直径5 mm的碳化钨圆珠(Qiagen， Retsch GmBH， Germany)，用振荡器振荡混匀30 s后，在组织破碎仪(Qiagen Tissue-Lyser， Retsch GmBH，Germany)上均以20 Hz的频率进行90 s的破碎，冰浴1 min后在4 ℃， 109 564 m/s2下离心10 min，取上清另置于新的2 mL的EP管中，重复破碎提取过程3次. 将上清集合挥去有机溶剂后使用冷冻干燥机(Cooling Trap Pro，Scanlaf， Denmark)冷冻干燥，将干燥组织提取物粉末加入600 μL组织提取缓冲溶液(0.1 mol/L，K2HPO4∶NaH2PO4=4∶1， 0.001% TSP-d4， 0.1%NaN3， pH 7.4，肝脏使用50%的D2O配制，肾脏使用80%的D2O配制)，在4 ℃， 109 564 m/s2下离心10 min，取上清550 μL置于直径5 mm NMR管中.1.2.2 核磁共振检测尿样和组织提取物使用配有超低温探头(CyroProbe)的Bruker AVIII 600型NMR 谱仪(Bruker Biospin， Germany)进行检测，质子共振频率为600.13 MHz，采用脉冲序列noesygppr1d (RD-90°-t1-90°-tm-90°-采样)，温度设定为298 K，时域采样点数均为32 k，谱宽12 000 Hz，累加次数均为64. 处理参数设置如下，变化点为64 k，指数线宽因子为1 Hz，相位和基线校正后以TSP峰中心位置δ0进行化学位移定标.血浆样品使用配有常规BBI探头的Bruker AVII 500型NMR谱仪(Bruker Biospin， Germany)进行检测，质子共振频率为500.13 MHz，每个样品采集3个类型的谱： (1) 预饱和的1D NOESY谱，使用序列noesypr1d(90°-t1-90°-tm-90°-采样)，用于检测血浆中所有代谢物的信息； (2) 预饱和的1DCPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)[16]，采用脉冲序列cpmgpr1d [RD-90°-(τ-180°-τ)n-采样]，这是横向弛豫时间T2编辑的谱，用来过滤大分子信息以获取小分子代谢物的信息；2 nτ为70 ms. (3) 水峰压制的扩散加权谱，使用采样序列ledbpgppr2sld[17] [RD-90°-G1-τ-180°-G2-τ-90°-Δ-90°-G3-τ-180°-G4-τ-90°-Te-90°-采样]，τ为400 μs，Δ为200 ms， Te为5 ms. 以上3种谱的累加次数均为256，谱宽为10 000 Hz，时域采样点数为32 k. 处理参数设置如下，变化点数64 k，指数线宽因子为1 Hz，相位和基线校正后将α-葡萄糖H1位信号的左峰设定为δ 5.233作为化学位移定标. 以上的所有样品的NMR谱图处理均在TopSpin Package (V3.0.b.8, Bruker Biospin, Germany)上进行.对于各种样品中代谢物的归属，在1D 1H NMR谱的基础上，要借助于2D NMR谱. 每种样品中选择有代表性的某一个或几个样品，分别采集COSY，TOCSY， J-Res， HSQC， HMBC五种二维谱. 尿样在配有超低温TXI探头的Bruker AVIII 800型NMR谱仪(Bruker Biospin，Germany)上获取二维谱信息，质子共振频率800.13 MHz，使用的脉冲序列分别为cosygpprqf，mlevgpphprw5， Jresqfpr， hsqcetgpsisp2.2pr， hmbcgplpndprqf，温度设定为298 K，谱宽分别为(F2/F1)8 400 Hz/8 400 Hz， 8 400 Hz/8 400Hz，8 400Hz/50 Hz， 8 400Hz/140 000 Hz， 8 400Hz/176 000 Hz， FID累加次数分别为64， 80， 48， 320， 400，采样点数分别为(直接维F2/间接维F1)2 048/200， 2 048/160， 4 096/64， 2 048/100， 2 048/100.血浆及组织提取物样品在配有TXI探头的Bruker AVIII 600型NMR谱仪(Bruker Biospin， Germany)进行检测，质子共振频率600.13 MHz. 有所不同的是，血浆样品TOCSY使用的是dipsi2phpr序列，其他序列相同，所使用的实验参数根据样品的不同，做了相应的测试和调整.通过二维谱进行耦合和连接信息的统计，确定物质结构. 其中J分解谱能反映出化学位移和J耦合的信息，直接确定谱峰裂分数量. COSY谱通过相邻核的 1H-1H之间的J耦合建立相邻核的联系，体现在谱上出现相邻质子间的交叉峰. TOCSY谱也是 1H-1H之间的J耦合，但是扩大到分子体系内所有有J耦合的质子信息. HSQC谱可以将直接相连的 1H与13C联系起来， HMBC则是显示 1H与13C长程耦合的信息，以及季碳原子和其他碳氢基团的联系信息. 此外，不同的基团虽然会因为化学环境的不同和耦合的不同导致化学位移有差别，但是类似基团的化学位移都是类似的，例如甲基基团一般都在δ 1.0附近，芳香族化合物的苯环信号多在δ 6.5～8.0左右. 通过逐步清晰的耦合信息，可以逐渐构筑出物质的结构，最终归属代谢物.2 结果与讨论尿样、血浆、肝肾组织提取物 1H NMR谱图如图1所示，其中选取有代表性的1H NMR谱图进行代谢物标注，这些图谱分别来自雄性昆明小鼠71周尿样、雌性昆明小鼠39周尿样、雌雄昆明小鼠71周混合血样、雌性昆明小鼠的51周肝脏提取物、雄性昆明小鼠的26周肾脏皮质提取物. 结合1H NMR谱的化学位移、谱峰裂分模式以及一系列2D NMR图谱所提供的耦合信息，并结合参考文献和代谢物数据库(MMCD, HMDB, HMRB等)[16,18-24]，对样品中的代谢物进行了信号归属. 从4类样品中共归属出82种主要代谢产物，其中尿样中有46种，血样中有32种，肝脏提取物中有43种，肾脏皮质提取物中有39种(部分代谢物种类有重叠). 有关归属的代谢物编号对应物质及 1H信息见表1. 各种样品中检测出的物质不尽相同，尿样中主要有三羧酸循环的中间产物(柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等)、能量代谢产物(肌酸、肌酸酐等)、氨基酸及氨基酸的转化物(甘氨酸、丙氨酸、 3-羟基异戊酸、α-酮异己酸、 2-酮异戊酸)、有机羧酸(甲酸、乙酸、丁酸、戊酸、异戊酸等)、胺类(甲胺、二甲胺、三甲胺、氧化三甲胺等)、以及和肠道菌群有关的代谢产物(马尿酸、苯乙酰甘氨酸等)；血浆中主要有氨基酸类(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等)、短链脂肪酸、有机羧酸、糖类(葡萄糖等)、胆碱类(胆碱、磷脂酰胆碱、甘油磷脂酰胆碱等)等物质；肝脏和肾脏提取物中代谢物种类较为类似，主要有氨基酸类、糖类、胆碱类、核酸类(腺苷、腺苷酸、磷酸腺苷、肌苷、肌苷酸、磷酸肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等)、胺类、胆汁酸等物质.尿样中小分子物质较多，而且大部分物质浓度较低，使得在NMR谱中信号较小并且重叠部分较多，加大了物质归属的难度. 高场区δ 0.8～1.5为CH3信号较为集中的区域，由于尿样中短链羧酸、氨基酸及其转化物结构相似，造成其CH3信号会在此处高度重叠，需要对此处进行明确的归属. 图2显示的是尿样COSY 谱的高场区，已归属信号物质为戊酸、丁酸、异戊酸、α-酮异己酸、 2-酮异戊酸、 2-酮丙二酸等.图1 1H NMR图谱及信号归属. (a) 第71周雄性昆明小鼠的尿样； (b) 第39周雌性昆明小鼠的尿样； (c) 第71周昆明小鼠血浆样品的混合物； (d) 第51周雌性昆明小鼠的肝脏提取物; (e) 第26周雄性昆明小鼠肾脏皮质提取物. 图中编号为代谢物名称见表1Fig.1 1H NMR spectra and assignments. (a) urine from male KM mice of 71 weeks old; (b) urine from female KM mice of 39 weeks old; (c) mixture plasme from KM mice of 71 weeks old; (d) liver extracts from female KM mice of 51 weeks old; (e) kidney extracts from nale KM mice of 26 weeks old表1 昆明小鼠尿样、血浆、肝脏和肾脏皮质提取物的代谢物信号归属Table 1 Metabolites assignments of urine, plasma, liver and kidney extracts序号代谢物归属δH和峰多重性a体液或组织b1戊酸(Valericacid)αCH2,βCH2,γCH2,δCH32.30(t),1.62(m),1.30(m),0.88(t)U2丁酸(Butyrate)αCH2,βCH2,γCH32.28(t),1.62(m),0.93(t)U3异戊酸(Isovalerate)αCH2,βCH,γCH32.10(d),2.02(m),0.93(d)U4α-酮异己酸(α-ketoisocaproate)βCH2,δCH3,γCH2.66(d),2.07(m),0.94(d)U5乙酸(Acetate)CH31.92(s)U,P,L,K62-酮异戊酸(2-Ketoisovalerate)βCH,γCH33.03(dq),1.13(d)U7丙二酸二甲酯(Methylmalonate)CH3,CH1.25(d),3.17(q)U8苹果酸(Malate)βCH2(1/2),βCH2(1/2),γCH2.38(dd),2.69(dd),4.31(dd)U9丙酮酸(Pyruvate)CH32.38(s)U,P10琥珀酸(Succinate)CH22.41(s)U,P,L,K11α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)βCH2,γCH23.01(t),2.44(t)U12丙氨酸(Alanine)αCH,βCH33.79(q),1.49(d)U,P,L,K13柠檬酸(Citrate)CH2(1/2),CH2(1/2)2.55(d),2.68(d)U,P14甲胺(Methylamine)CH32.61(s)U15二甲胺(Dimethylamine)CH32.72(s)U,L,K16三甲胺(Trimethylamine)CH32.88(s)U,P,L,K17二甲基甘氨酸(Dimethylglycine)CH3CH22.93(s)3.72(s)U18肌酸(Creatine)CH3,CH23.04(s),3.94(s)U,P,L,K19肌酸酐(Creatinine)CH3,CH23.05(s),4.06(s)U20胆碱(Choline)N(CH3)3,N-CH2,O-CH23.21(s),3.55(t),4.08(t)U,P,L,K21氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide)CH33.27(s)U,L,K22牛磺酸(Taurine)CH2-SO3,CH2-NH3.27(t),3.43(t)U,L,K231-甲基烟酰胺(1-methylnicotinamide)CH3,H2,H4,H5,H64.48(s),9.29(s),8.97(d),8.19(d),8.91(d) U243-羟基-异戊酸(3-hydroxy-isovalerate)αCH2,γCH32.37(s),1.21(s)U25乙醇胺(Ethanolamine)N-CH2,O-CH23.15(t),3.83(t)U,K26延胡索酸(Fumarate)CH6.53(s)U,P,L,K续表1Continuation of the Table 1序号代谢物归属δH和峰多重性a体液或组织b27马尿酸(Hippurate)CH2,H2/H6,H3/H5,H43.97(s),7.84(d),7.55(t),7.64(t)U28甲酸(Formate)CH8.46(s)U,P,L,K29甘氨酸(Glycine)CH23.57(s)U,P,L,K30苯乙酰甘氨酸(Phenyla cetylglycine)αCH2,γCH2,H2/H6,H3/H5,H43.76(d),3.68(s),7.42(s),7.3 3(t),7.35(t)U31胍基乙酸(Guanidoacetate)CH23.80(s)U,K324-羟基苯丙酸2-(4-hydroxyphenyl) propanoicacidαCH,βCH3,H2/H6,H3/H53.59(m),1.38(d),6.88(d),7.21(m)U332-酮丙二酸(2-ketoadipate)βCH2,γCH2,δCH22.77(t),1.84(m),2.25(t)U34乳酸(Lactate)αCH,βCH34.12(q),1.34(d)U,P,L,K352-羟基异丁酸(2-hydroxyisobutyrate)CH31.36(s)U36丙二酸(Malonate)CH23.12(s)U373-脲基丙酸(3-ureidopropionate)αCH2,βCH22.38(t),3.31(q)U38顺乌头酸(cis-Aconate)CH2,CH3.12(s),5.70(s)U39鸟嘌呤(Guanine)CH7.69(s)U40吲哚磺酸盐(Indoxylsulfate)H2,H4,H5,H6,H77.36(s),7.71(d),7.21(dd),7.28(dd),7.51(d)U41N-乙酰谷氨酸(N-Acetylglutamate)αCH,βCH2,βCH2,γCH2,CH34.08(m),1.88(m),2.06(m),2.24(t), 2.02(s)U42尿刊酸(Urocanate)CH-COO,CH(ring),H3,H56.40(d),7.31(d),7.87(s),7.36(s)U434-甲酚葡糖醛酸(4-cresol glucuronide)CH3,CH,H2/H6,H3/H52.30(s),5.09(d),7.07(d),7.23(d)U44次牛磺酸(Hypotaurine)S-CH2,N-CH22.67(t),3.36(t)U45N-乙酰甘氨酸(N-Acetylglycine)CH3,CH22.06(s),3.76(d)U46N-乙酰糖蛋白(N-acetyl-glycoproteins)CH32.06(s)U,P47O-acetyl-glycoproteinsCH32.14(s)P48谷氨酰胺(Glutamine)αCH,βCH2,γCH23.78(m),2.12(m),2.45(q)P,L,K49谷氨酸(Glutamate)αCH,βCH2,γCH23.76(m),2.10(m),2.34(m)P,L,K续表1Continuation of the Table 1序号代谢物归属δH和峰多重性a体液或组织b50亮氨酸(Leucine)αCH,βCH2,γCH,δCH3,δCH33.76(t),1.74(m),1.70(m),0.95(d),0.96(d)P ,L,K51异亮氨酸(Isoleucine)αCH,βCH3,βCH,γCH2(1/2),γCH2(1/2),δCH33.69(d),1.00(d),2.00( m),1.25(m),1.46(m),0.93(t)P,L,K52缬氨酸(Valine)αCH,βCH,γCH3,γCH33.60(d),2.27(m),0.98(d),1.03(d)P,L,K533-羟基丁酸(D-3-hydroxybutyrate)αCH2(1/2),αCH2(1/2),βCH,γCH32.30(dd),2.40(dd),4.15(dt), 1.19(d)P,L,K54β-葡萄糖(β-glucose)H1,H2,H3/H5,H4,CH2-C6(1/2),CH2-C6(1/2)4.65(d),3.24(m),3.46(m),3.40(m),3.76(dd),3.90(dd)P,L,K55α-葡萄糖(α-glucose)H1,H2,H3,H4,H5,H65.23(d),3.54(dd),3.71(m),3.40(m),3.82(m),3.83(m )P,L,K56甜菜碱(Betaine)N(CH3)3,N-CH23.27(s),3.91(s)P,L,K57酪氨酸(Tyrosine)αCH,βCH2(1/2),βCH2(1/2),H2/H6,H3/H53.96(m),3.05(m),3.14(m),7 .19(d),6.89(d)P,L,K581-甲基组氨酸(1-methylhistidine)CH3,αCH,βCH2(1/2),βCH2(1/2),H2,H43.67(s),3.96(dd),3.07( d),3.13(d),7.76(s),7.05(s)P59苯丙氨酸(Phenylalanine)αCH,βCH2(1/2),βCH2(1/2),H2/H6,H3/H5,H43.98(m),3.11(m), 3.28(m),7.30(d),7.40(m),7.35(m)P,L,K60苏氨酸(Threonine)αCH2,βCH2,γCH33.57(d),4.25(m),1.33(d)P,L,K61肌醇(myo-inositol)H1/H3,H2,H4/H6,H53.54(m),4.07(t),3.63(dd),3.28(t)K62赖氨酸(Lysine)αCH2,βCH2,γCH2,δCH2,εCH23.76(t),1.49(m),1.78(m),1.92(m),3.00(t) P,L,K63磷脂酰胆碱(Phosphocholine)N(CH3)3,N-CH2,O-CH23.22(s),3.62(t),4.24(t)P,L,K64甘油磷脂酰胆碱(Glycerophosphocholine)N(CH3)3,N-CH2,O-CH2,P-CH2,P-CH23.22(s),3.62(m),3.67(t),3.91(m),4.32(t)P,L65脂质(Lipid)CH3,(CH2)n,CH2-C=C,CH2-C=O,C-CH2-C=,-CH=CH-0.85(m),1.27(m),2.00(m),2.23(m),2.74(m),5.30(m)P66不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acid)CH=CH2.74(m),5.30(m)P67氧化型谷胱甘肽GluL(Glutathione,oxidized)α-CH2,β-CH2,γ-CH23.79(m),2.17(m),2.54(q)Cysα-CH2,β-CH2,β-CH24.77(m),2.97(m),3.32(m) 续表1Continuation of the Table 1序号代谢物归属δH和峰多重性a体液或组织b68尿苷(Uridine)CH2(1/2),CH2(1/2),H(a),H(b),H(c),H(d),H5,H63.80(m),3.90(m),5.91(d ),4.36(t),4.24(t),4.12(m),5.93(d)7.89(d)L,K69肌苷(Inosine)CH2(1/2),CH2(1/2),H2,H8,H2',H3',H4',H5'3.91(dd),3.93(dd),8.36(s),8 .25(s),6.11(d),4.79(s),4.45(dd),4.29(dd)L,K70尿嘧啶(Uracil)H5,H65.81(d),7.55(d)L,K71烟酰胺(Niacinamide)H1,H2,H3,H48.95(s),8.72(dd),7.60(dd),8.27(dd)L,K72次黄嘌呤(Hypoxanthine)H2,H78.20(s),8.22(s)L,K73腺嘌呤(Adenine)H2,H78.10(s),8.11(s)L74糖原(Glycogen)C-OH,C-OH,CH2,C-OH,O-CH-O(H)3.42(m),3.59(m),3.79(m),3.98(br,s),5.43(br,s)L75天冬氨酸(Aspartate)αCH,βCH2(1/2),βCH2(1/2) 3.90(dd),2.68(dd),2.82(dd)L,K76天冬氨酰(Asparagine)αCH,βCH2(1/2),βCH2(1/2) 4.00(m),2.88(dd),2.96(dd)L775-磷酸肌苷(Inosine 5'-monophosphate)PO-CH2,O-CH,HO-CH,HO-CH,O-CH-N,H3,H74.02(d),4.26(dd),4.52(d),4.78(d),6.16(d),8.20(s),8.57(s),L,K78黄嘌呤(Xanthine)CH7.96(s)L,K79腺苷酸(Adenosine)CH2,O-CH,HO-CH,HO-CH,O-CH-N,H3,H73.86(m),4.29(q),4.42(dd),4.73(s),5.99(d),8.12(s),8.28(s)L80胆汁酸(Bile acid)CH3,CH30.74(s),0.86(s)L81磷酸腺苷(Adenosine monophosphate)CH2,O-CH,HO-CH,HO-CH,O-CH-N,H3,H74.03(dd),4.38(dd),4.52(dd),4.78(d),6.15(d),8.27(s),8.60(s)L82γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate)αCH2,βCH2,γCH22.30(t),1.90(m),3.01(t)Ka. 峰的类型： s，单峰； d，双峰； t，三重峰； q，四重峰； m，多重峰；dd，双重双重峰； dt，双重三重峰； dq，双重四重峰b. U, P, L, K分别代表尿液(urine)、血浆(plasma)、肝脏提取物(liver extracts)及肾脏提取物(kidney extracts)图2 尿样COSY图谱及部分信号归属Key： 1.戊酸(Valeric acid); 2.丁酸(Butyrate); 3.异戊酸(Isovalerate); 4.α-酮异己酸(α-ketoisocaproate); 6.2-酮异戊酸(2-Ketoisovalerate); 33.2-酮丙二酸(2-ketoadipate)Fig.2 Urine COSY spectrum and assignments图3 血浆COSY图谱及葡萄糖信号归属Key：54. β-葡萄糖(β-glucose); 55. α-葡萄糖(α-glucose)Fig.3 Plasma COSY spectrum and assignments血浆中由于葡萄糖信号较强，因此在1D 1H NMR谱中对于其他物质信号的掩盖性较大，因此血浆代谢物归属要首先在二维谱中识别出全部的葡萄糖信号，才能进一步对其他物质进行归属. 图3显示的是血浆的COSY谱图，对其中的葡萄糖信号归属已经全部标出.对于肝脏和肾脏等组织来说，由于含有大量的核苷类物质，而且浓度较低，信号较弱，使得低场区的信号归属难度较大，图4显示的是肝脏提取物的COSY谱，对已经识别的低场区信号进行了归属，主要为含有环状结构的物质，如酪氨酸、苯丙氨酸、尿苷、肌苷、尿嘧啶、腺苷酸、烟酰胺、磷酸腺苷等.图4 肝脏提取物COSY图谱及低场区信号归属Key： 57. 酪氨酸(Tyrosine); 59.苯丙氨酸(Phenylalanine); 68.尿苷(Uridine); 69.肌苷(Inosine); 70.尿嘧啶(Uracil); 71. 烟酰胺(Niacinamide); 79.腺苷酸(Adenosine); 81. 磷酸腺苷(Adenosine monophosphate)Fig.4 Liver extracts COSY spectrum and assignments由于NMR的检测灵敏度相对较低，部分浓度较低的代谢物信号强度较弱，在二维谱中很难看清 1H-1H和 1H-13C的连接，需要进行SPE的富集之后进行进一步的解析和归属. 而对于血浆中的脂类等大分子物质指认也比较困难，需要借助其他方法(LC-DAD-MS或GC-MS等)对代谢物进行更全面的解析.3 结论通过NMR方法，对昆明小鼠尿液、血浆、肝脏和肾脏提取物进行了检测，共确定了82种代谢物的NMR信号. 在正常的生理状态下，尿液中代谢物主要包含三羧酸循环的中间产物、能量代谢产物、氨基酸及氨基酸的转化物、有机羧酸、胺类代谢物、以及和肠道菌群有关的代谢产物；血浆中代谢物主要有氨基酸类、短链脂肪酸、有机羧酸、糖类(葡萄糖等)、胆碱类等物质；肝脏和肾脏提取物中代谢物主要有氨基酸类、糖类、胆碱类、核酸类、胺类代谢物、胆汁酸等物质. 涉及了三羧酸循环、糖酵解途径、氨基酸代谢、脂类代谢、核酸代谢、胆碱代谢、胺类代谢等代谢途径. 在确定了NMR信号是何种物质之后，才能进一步对生物体的动态代谢变化进行分析. 本文对于昆明小鼠尿液、血浆、肝脏和肾脏提取物的代谢物进行NMR分析，提供了昆明小鼠的基础代谢组数据，为后续的以昆明小鼠为动物模型的其他代谢组学实验提供了基础信息.参考文献:【相关文献】[1] Zhang Gen-mu(章根木), Yao Gan-huo(姚甘火). 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“肝脏代谢组学”资料汇总目录一、基于LCMS技术的二氢丹参酮抗肝纤维化肝脏代谢组学研究二、基于肝脏代谢组学的柴胡白芍药对抗抑郁作用机制研究三、参苓白术散干预非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏代谢组学研究四、基于肠道菌群和肝脏代谢组学研究柑橘类黄酮对非酒精性脂肪肝病的保护作用五、基于1HNMR肝脏代谢组学的白芍抗抑郁作用研究基于LCMS技术的二氢丹参酮抗肝纤维化肝脏代谢组学研究随着环境污染和生活方式的改变，肝纤维化已经成为全球范围内的主要公共卫生问题之一。

二氢丹参酮作为一种具有抗肝纤维化作用的中药活性成分，受到了广泛关注。

然而，其作用机制仍不完全清楚。

为此，我们采用基于液相色谱质谱联用技术（LCMS）的代谢组学方法，对二氢丹参酮抗肝纤维化的肝脏代谢组学进行研究。

实验采用四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型，随机分为对照组和二氢丹参酮治疗组。

经过连续给药后，收集肝脏组织进行代谢组学分析。

通过液相色谱质谱联用技术（LCMS）检测肝脏代谢产物的变化，结合生物信息学方法，分析二氢丹参酮对肝纤维化大鼠肝脏代谢的影响。

实验结果表明，二氢丹参酮能够显著改善肝纤维化大鼠的肝功能指标，减轻肝组织病理损伤。

在代谢组学方面，与对照组相比，治疗组大鼠肝脏中多种代谢产物发生了显著变化，涉及脂肪酸代谢、氨基酸代谢和能量代谢等多个方面。

这些变化表明二氢丹参酮可能通过调节肝脏代谢网络来发挥抗肝纤维化作用。

我们还发现二氢丹参酮能够上调大鼠肝脏中一些关键酶的表达，如脂肪酸合成酶和丙酮酸激酶等。

这些酶在肝脏代谢过程中起着至关重要的作用。

因此，我们认为二氢丹参酮的抗肝纤维化作用可能与这些酶的表达调控有关。

本研究采用基于LCMS技术的代谢组学方法，对二氢丹参酮抗肝纤维化的肝脏代谢组学进行了研究。

结果表明，二氢丹参酮可能通过调节肝脏代谢网络来发挥抗肝纤维化作用。

这些发现为深入理解二氢丹参酮的作用机制提供了重要依据，并为开发新的抗肝纤维化药物提供了思路。

基于肝脏代谢组学的柴胡白芍药对抗抑郁作用机制研究抑郁症是一种常见的精神疾病，其症状包括情绪低落、失去兴趣、疲劳、失眠等。

基于核磁共振技术的定量代谢组学研究江春迎, 王映红*(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050)摘要: 核磁共振技术 (NMR) 既可用于混合体系的定性分析, 又可以用于其定量分析。

在过去的几十年里,随着分析技术以及各种实验技术的迅速发展, 基于核磁共振的定量分析方法已广泛应用于生物样本的分析。

核磁共振定量分析技术应用于代谢组学, 并成为定量代谢组学 (quantitative metabolomics) 研究中的重要手段。

本文将论述这种新分析方法相比于传统方法的优势及不足之处, 同时论述其研究过程中需考虑的重要因素以及其在代谢组学研究中的应用。

关键词: 核磁共振; 代谢; 代谢组学中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014) 07-0949-07Quantitative metabolomics based on NMRJIANG Chun-ying, WANG Ying-hong*(State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)Abstract: Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can be used to both identify and quantify chemicals from complex mixtures. Over the last several decades, significant technical and experimental advances have made quantitative nuclear magnetic resonance (qNMR) a valuable analytical tool for quantitative measurements of a wide variety of samples. This particular approach is now being exploited to characterizethe metabolomes of many different biological samples and is called quantitative metabolomics or targeted metabolic profiling. In this review, some of the strengths, limitations of NMR-based quantitative metabolomicswill be discussed as well as the practical considerations necessary for acquisition with an emphasis on their use for bioanalysis. Recent examples of the application of this particular approach to metabolomics studies will be also presented.Key words: qNMR; metabolism; metabolomics代谢 (metabolism) 是生命活动中所有生物化学反应的总称, 代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。

[作者单位]南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所 (南京,210002)代谢组学及其研究方法和应用陈慧梅　综述　刘志红　审校关键词　代谢组学　核磁共振　质谱　代谢产物 代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后,系统生物学的重要组成领域[1]。

代谢组学的研究可以追溯至上世纪80年代。

1985年,N ichols on 研究小组利用核磁共振(NMR )技术分析大鼠的尿液,意识到这可能是生命科学研究的巨大突破[2],并于1999年,提出了代谢组学(metabonom 2ics )的概念。

代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中,所有代谢组分的集合,尤其指小分子物质”,而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。

细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等,故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。

基因与蛋白质的表达紧密相连,代谢物则更多地反映了细胞所处的环境,如营养状态,药物和环境污染等影响。

正如B illy David 所言:“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么”[3]。

其具体的内容:11基因组学研究的是生物体在一定的病理生理条件下,基因表达谱的改变。

但“沉默基因”及基因之间的互相调控,使得基因的“开”、“关”与生物学效应并无直接联系。

而且不能与生物体作用的靶位点直接联系。

21蛋白质组学主要是针对细胞蛋白质的变化,进行半定量测定。

蛋白质是生理功能的执行者,研究它可以很大程度地揭示病理生理机制,发现疾病的生物标志。

但蛋白质组学也存在信号通路蛋白相互影响,靶位点难以定位等缺点,而且不能动态、实时的反映整体信息。

31代谢组学关注的是各种代谢路径底物和产物的小分子代谢物(MW <1K D ),反映细胞或组织在外界刺激或是遗传修饰下代谢应答的变化,包括糖、脂质、氨基酸、维生素等。

核磁共振谱技术在代谢组学中的应用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）谱技术是一种分析物质结构的非常重要的手段，它基于原子核与磁场和电磁波作用的现象，能够分析分子的结构、组成和动力学等。

在生物医学领域中，代谢组学是应用NMR谱技术的主要领域之一。

代谢组学研究通过分析体液样品中代谢产物的谱图，可以发现异常代谢的类型和程度，诊断、预测疾病、评估药物影响等。

本文将从技术原理、研究进展、临床应用等方面综述核磁共振谱技术在代谢组学中的应用。

一、技术原理核磁共振谱技术是利用分子内部的核自旋和分子与周围环境的相互作用和分子运动的特性来探测分子结构和动力学。

当分子置于强磁场之中，分子内部的核自旋将会先沿着磁场方向取向，然后通过与磁场垂直的电磁波的辐射，跳转到另外一个能量势阱，这个能量势阱称为共振态。

分子中的不同原子核具有不同的谱学信号，NMR谱的主要信号来源于氢、碳、氮、磷等核自旋。

二、研究进展1.代谢组学的基础研究核磁共振技术被广泛应用于代谢组学的研究中，通过分析体液样品中代谢产物的谱图，可以快速、直接地了解疾病患者的代谢情况。

鉴定谱图中哪些代谢产物的水平发生改变，并确定这些代谢物与特定生物过程的关系，进而推断出生物学上的变化，从而为疾病发生机理的研究提供新的途径。

2.代谢组学在乳腺癌研究中的应用核磁共振代谢组学技术已经被应用于乳腺癌研究。

在这些研究中，通过NMR技术分析患者血清、尿液和组织样品中的谱图，可以发现一些代谢物在癌症患者的体内水平明显升高或降低，如脂肪酸、糖类和脂类等代谢物。

这些研究结果不仅可以用于乳腺癌患者的诊断和预测，还可以利用代谢组学技术研究乳腺癌发病机制，有助于寻找新的治疗方法。

3.代谢组学在糖尿病研究中的应用核磁共振技术在糖尿病代谢组学研究领域也得到了广泛关注。

通过分析血清、尿液和组织样品的NMR谱图，可以发现糖尿病患者的代谢谱有明显区别。

这些差异可以用于糖尿病的早期诊断和诊断分型，也为糖尿病的研究提供了新的思路和方法。

高效液相色谱-质谱联用技术在代谢组学中的应用进展摘要：代谢组学是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析, 从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。

而高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）作为代谢组学中一种重要的分离检测方法，在代谢组学中有着方方面面的应用。

本文介绍代谢组学中的高效液相色谱-质谱联用技术，并从药物分析、生理病理代谢、临床诊断标志物和细胞鉴定等方面介绍高效色谱-质谱联用技术在代谢组学中的应用。

关键词：高效液相色谱-质谱联用技术；代谢组学代谢组学的研究目的就是从尿液、血浆、血清、唾液和胆汁等生物体终端样本中检测代谢物，或跟踪代谢水平整体的动态变化，提取“组学”信息，以此来反映生物体在外源刺激作用下的体内生物学过程变化情况。

代谢组学研究的基本流程包括样品采集、预处理、代谢组分析、数据分析以及研究结果的解释与应用等。

1.检测工具其中的样品采集分离与分析离不开分离检测工具。

常用的分离检测工具包括色谱(Chromatography)、质谱(Mass Spectrometry，MS)、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)等。

【1】1.1核磁共振（NMR）NMR快速、选择性好,其样品处理简单且不造成破坏,只要含氢的代谢物都可以被检测,即可以对所有的分析对象达到无歧视分析。

对样品无损伤且重复性好,能够广泛应用于药物工业和病人的尿、血样分析。

样本制备简单且易自动化。

但是复杂混合物的NMR谱的解析非常困难。

对全面的代谢谱图分析, NMR最大的缺陷是灵敏度相对较低, 从而使得它不适合分析大量的低浓度代谢物。

【2】所需硬件投资也比较大1.2色谱（Chromatography）气相色谱(Gas Chromatography，GC)广泛用于微量、痕量组分的分析。

但是，气相色谱受组分挥发性和热稳定性的限制，需对样品进行衍生化处理。