胰蛋白酶的动力学研究

化学生物学小论文-胰蛋白酶的研究及应用
胰蛋白酶是一种酶类蛋白质，主要存在于胰腺的分泌液中。

它作为一种消化酶，在人体消化中扮演着非常重要的角色。

胰蛋白酶通过水解蛋白质的肽键来分解食物中的蛋白质成为小肽和氨基酸，以供身体吸收利用。

胰蛋白酶具有非常广泛的应用，主要有以下几个方面：
一、医学应用
胰蛋白酶可以用于治疗胰腺不足症和胰腺疾病等。

在胰腺不足症患者中，由于胰腺功能不良，使得胰蛋白酶分泌不足，导致无法对食物中的蛋白质进行消化分解。

而外源性添加胰蛋白酶可以补充消化酶，促进食物的消化吸收，对于保障机体营养具有非常重要的意义。

二、制药行业
胰蛋白酶作为生化制药行业中的一种重要原料，广泛应用于肿瘤、心血管、消化等领域。

通过在胰蛋白酶分子中特定位点上引入基团或者交联化学反应，可以显著增加其稳定性和活性，从而提高胰蛋白酶的制剂质量与产值。

三、食品加工
胰蛋白酶可以被应用于制作乳制品、肉制品、啤酒等食品。

在乳制品中，胰蛋白酶可以加速乳酸菌的生长与增殖，起到促进酸奶、发酵奶等乳制品中菌群发酵的效果。

在肉制品中，胰蛋白酶可以使其细腻、鲜嫩；在啤酒中，胰蛋白酶的加入可以提高酵母的生长率，促进酵母对麦芽中淀粉的消化利用。

总的来说，胰蛋白酶在医疗、生物制药、食品加工等领域中的应用十分广泛。

同时，尤其是在制药行业中，随着对胰蛋白酶安全性、纯度和活性质量的不断提高和发掘，胰蛋白酶将会在更多领域中得到应用。

大豆胰蛋白酶抑制剂对南极磷虾类胰蛋白酶的抑制动力学杭虞杰;李学英;杨宪时;迟海;郭全友【摘要】To study the kinetics of inhibition of trypsin-like protease from Euphausia superba by soybean trypsin inhibitor (STI), the kinetic theory by Tsou of irreversible inactivation was applied to measure its microscopic rate constants. The values of A"mand max were 0.155 mmol/L and 8.44μmol/(Lmin), respectively. As the concentration of STI was increased, the activity decreased with IC50 of 2.8 μg/mL. STI slowly, reversibly and competitively inhibited the enzyme activity at low concentration. The rate constant of the forward inactivation (k+0) was 0.184 tnin-'1, which was about Five times higher than the value of 0.039 4 min"' for the reverse reactivation (k-0). Therefore, at sufficiently high STI concentrations, the enzyme would be completely inactivated. This study provides experimental data for further research into the inhibition technology of the trypsin-like protease from E. superba.%为了探讨大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对南极磷虾(Euphausia superba)类胰蛋白酶的抑制动力学,采用邹氏不可逆抑制动力学法,测定了STI对该酶的微观速度常数.结果表明:南极磷虾类胰蛋白酶的Km和Vmax分别为0.155mmol/L,8.44 μmol/(L·min).酶活力随着STI溶液浓度增大而减小,其IC50约为2.8 μg/mL;低浓度的STI溶液对酶的抑制作用为竞争性慢可逆抑制.正向微观速度常数k+0为0.184 mmol/(L·min),逆向微观速度常数k.o为0.0394min-1,随着STI溶液浓度的逐渐增大,该酶最终将完全失活.本研究旨为该酶的抑制技术研究提供实验数据.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2012(019)004【总页数】6页(P635-640)【关键词】南极磷虾;抑制动力学;大豆胰蛋白酶抑制剂;类胰蛋白酶【作者】杭虞杰;李学英;杨宪时;迟海;郭全友【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,上海,200090;上海理工大学医疗器械与食品学院,上海,200093;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海,200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海,200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海,200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海,200090【正文语种】中文【中图分类】Q946.5南极磷虾(Euphausia superba)作为南大洋最大的单种生物资源, 是海洋浮游动物中重要的物种之一, 是企鹅、海豹、鲸类等食物链高层捕食者的重要食物来源[1]。

生物学家研究酶催化反应的动力学酶催化反应是生物学中一个重要的研究领域，它涉及到生物体内许多生物化学反应的催化过程。

酶作为一类特殊的蛋白质，能够催化反应速率的提高，使得生物体内许多反应能够在相对较低的温度和压力下进行。

生物学家们通过研究酶催化反应的动力学，旨在深入理解酶催化反应的机制和调控方式。

动力学研究酶催化反应的过程中，主要关注以下几个方面：酶的底物亲和力、催化速率和反应过渡状态。

其中，酶的底物亲和力是指酶与底物之间的结合程度。

酶结合底物的能力取决于酶的空间构象和化学性质。

生物学家们通过研究酶底物之间的结合情况，可以揭示酶催化的选择性和特异性。

催化速率是指酶催化反应的速率，也即是反应速率常数。

反应速率常数可以通过测量反应物浓度随时间的变化来得到。

通过调控反应的条件，比如温度、pH值和底物浓度等，生物学家可以了解到酶催化反应的增强效应。

此外，通过测定酶的催化速率常数，可以计算出酶的催化效率，从而比较不同酶的催化能力。

反应过渡状态是指反应物与产物之间的临时状态，在反应过程中出现的中间物质。

研究酶催化反应的动力学，可以通过研究反应过渡态来揭示酶催化反应的机制。

例如，可以通过X射线晶体学或核磁共振等技术，解析酶与底物结合后的结构，从而解释酶催化反应的机制。

在研究酶催化反应的动力学过程中，生物学家们提出了多种模型来描述酶催化动力学。

其中，最经典的模型是Michaelis-Menten模型。

该模型假设酶与底物之间形成酶底物复合物，然后发生化学反应生成产物。

根据该模型，可以推导出酶的反应速率与底物浓度之间的关系，即Michaelis-Menten方程。

通过实验测定酶的反应速率常数和底物浓度，可以拟合出酶的酶底物结合常数、反应速率常数等动力学参数。

除了Michaelis-Menten模型，还有其他一些模型被用于描述酶催化反应的动力学，比如Lineweaver-Burk模型和Eadie-Hofstee模型。

这些模型在不同条件下可以更加准确地描述酶催化反应的动力学特征。

实验三：胰蛋白酶的动力学研究一.实验目的1.掌握酶的米氏常数km值和Vmax的测定原理和方法。

2.了解底物浓度对酶促反应速率的影响。

二.实验原理1.米氏方程：V=Vmax[S]/km+[S]V是反应初速度，[S]是底物浓度2.采用双倒数作图法，对1/V=km/(Vmax[S])+1/Vmax作图：Km/Vmax1/Vmax1/-Km3.本实验以酪蛋白为底物，来测定胰蛋白酶的km值氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：－NH3是弱酸，完全解离时PH为11－12或更高，若用碱滴定－NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。

常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0左右）。

因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。

如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。

但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。

三.试剂与仪器1.0.5%的胰蛋白酶溶液，用无离子水溶解。

2.酪蛋白酶溶液：40g/L，30 g/L，25 g/L，20 g/L，15 g/L，10 g/L，5g/L，2.5 g/L；用稀碱溶解。

3.0.25%的酚酞溶液：2.5g酚酞用50%的酒精溶解，定容至1L。

其变色范围是8.0—10.0（无色红色）。

4.中性甲醛溶液：75ml分析纯甲醛加15ml0.25%酚酞乙醇溶液，以0.01mol/lNAOH滴定至微红，密闭存放于棕色玻璃瓶中。

四.操作步骤1.组号 1 2 3 4 5 6 7 8所用底物浓度g/L 40 30 25 20 15 10 5 2.52.准备：7个50ml的三角瓶（分别编号：0 6），分别加入2.5ml中性甲醛与1滴酚酞（如果所取甲醛已是微红色，则不用加碱；若不是微红色，以0.01mol/lNAOH滴定至微红色）。

胰蛋白酶活性测定说明
详细介绍：
胰蛋白酶活性测定说明
原理：胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。

此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性
的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。

因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化
活性。

在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。

在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N-端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原分子量约为24000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23400，其等电点为pH10.8。

胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。

pH＜3时，胰蛋白酶易变性。

PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。

胰蛋白酶催化活性的最适pH 为7.6～7.8。

重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。

胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。

保存条件：
①胰蛋白酶底物粉剂：4℃保存条件下3个月内有效
②胰蛋白酶底物稀释液：4℃保存条件下3个月内有效
③样本匀浆介质：4℃保存条件下6个月内有效。

实验胰蛋白酶活力测定一、原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。

蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。

二、实验仪器试管7220分光光度计恒温水浴锅三、实验试剂福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml10%三氯乙酸溶液0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。

在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。

500ug/L 酪氨酸溶液 胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：0.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液654321管号各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。

以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。

样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂0 OD68011福林试剂B 5.05.0 0.55mol/L碳酸钠溶液37水浴中显色15分钟11上清液过滤3.03.0 10%三氯乙酸溶液1.00 2mg/ml胰酶溶液01.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液37水浴中酶解15分钟2.02.0 0.5%酪素溶液备注21管号五、结果计算酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。

胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。

测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。

下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。

实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。

2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。

3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。

4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。

5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。

6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。

实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。

用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。

2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。

黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。

通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。

数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。

2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。

注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。

2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。

3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。

从南极大磷虾蛋白酶中分 离出一种相对分 子量为 30 kD 的胰蛋白酶。 S j dah等 [ 17] 经过精确研究得到 南极大磷虾胰蛋白酶的相对分子量: TL I 25 02 kD, TL II 25 07 kD, TL III 25 06 kD。 2. 2 胰蛋白酶等电点的研究
采用聚丙烯酰胺凝胶电聚焦的技术手段, Sa inz 等 [ 15] 对南美白对虾 3种胰蛋白酶的等电点进行研 究表明, 3种胰蛋白酶 A、B、C 的 pI分别为 3. 5、3和 4. 5; 斑 节 对虾 两 种胰 蛋 白酶 等电 点 分别 为 2. 1、 2 4[ 11] ; Sa lam anca等 [ 16] 从南极大磷虾蛋白酶中分离 出的胰蛋白酶 pI为 4. 1。
胰蛋白酶作为动物体内重要的蛋白消化酶类, 研究者对于人类及陆生动物如鼠、狗、牛和猪等胰蛋 白酶的研究较多。近年来, 随着水产养殖业的发展, 虾类消化酶的研究也逐渐形成, 主要是研究对虾养 殖过程中不同饲料、生长阶段、水体环境下虾类消化 酶活性状况, 并以此为依据选择合适的虾类养殖条
件。关于虾类胰蛋白酶的基础性研究, 国外比国内 开展得早。迄今为止, 已研究报道了南极大磷虾、南 美白对虾、斑节对虾、印度对虾、东方扁虾、太平洋大 磷虾、凡纳滨对虾和中华齿米虾等虾类胰蛋白酶。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin
2011年第 2期
crangon总蛋白酶活性在 pH 5- 7之间活性很高, 且 最适 pH 在 5. 5- 6。 N avarrete del T oro等 [ 24] 报道了 欧洲龙虾 (钩虾 ) 的胰蛋白酶活性即使在酸性 pH 条 件下也可保持很高的活性, 且其活性可被胰蛋白酶 抑制剂完全抑制。 2. 4 胰蛋白酶最适温度的研究

胰蛋白酶动力学概述胰蛋白酶动力学（Protease Kinetics）是一种应用于生物学和化学中的重要技术，它可以帮助我们理解蛋白质以及其他大分子的结构和功能。

它可以帮助我们深入了解各种蛋白质的分解过程，以及如何影响它们的作用。

在药物开发、食品和饮料行业、生物制造业和其他行业中，胰蛋白酶动力学的应用也变得越来越广泛。

胰蛋白酶动力学是一种非常复杂的技术，它不仅可以帮助我们深入了解蛋白质的分解过程，而且可以帮助我们提高制造过程中的效率。

胰蛋白酶动力学通常包括对蛋白质的几种不同测试，以及使用计算机模拟来确定最佳条件。

这些测试可以帮助我们更好地理解蛋白质的活性，从而能够更好地控制蛋白质的分解过程。

原理胰蛋白酶动力学主要是研究蛋白质的分解过程，即胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶是一种有效的蛋白质酶，它可以帮助人体消化食物中的蛋白质，从而为人体提供必要的营养物质。

胰蛋白酶的活性可以受到许多因素的影响，如pH 值、温度、氧化剂以及其他化学物质的浓度。

胰蛋白酶动力学可以帮助我们了解这些因素对胰蛋白酶活性的影响，从而可以更好地控制其分解过程。

胰蛋白酶动力学通常使用反应动力学来研究蛋白质的分解过程。

反应动力学是一种用于研究化学反应的方法，反应动力学可以帮助我们了解化学反应的机理，从而使我们能够更好地控制它们。

反应动力学可以用来研究蛋白质的分解过程，可以帮助我们了解蛋白质分解过程中的各种因素，并确定最佳条件以控制蛋白质分解的进程。

工作原理胰蛋白酶动力学可以用来研究蛋白质的分解过程。

它的工作原理是通过分析蛋白质分解的时间和活性来确定最佳条件。

首先，将胰蛋白酶和一定量的蛋白质混在一起，然后记录蛋白质的分解情况，并记录每一步的时间。

这样，可以确定蛋白质分解的速率，从而得出最佳的分解条件。

在实验中，可以使用不同的参数（如温度、PH值、氧化剂浓度等）来控制蛋白质分解的过程，以便找到最佳的蛋白质分解条件。

此外，可以使用模拟计算来比较不同参数下蛋白质分解的效果，从而确定最佳参数。

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。

实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。

胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。

酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。

胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。

这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。

不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。

E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。

在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。

器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。

试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。

1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。

2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶有限酶解米渣蛋白的机理及动力学模型研究李湘;彭地纬;熊华;赵强;李薇【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2009(030)021【摘要】运用实验研究结合数学推导的方法,采用胰蛋白酶在温度53℃、pH 7.6条件下对酶解米渣蛋白的动力学机制进行研究.结果表明:在反应过程中底物存在着促进反应进行和抑制酶活性的双重作用,酶催化的水解速率随水解进程呈指数下降;并由实验数据推导出描述胰蛋白酶催化水解米渣蛋白的动力学方程及胰蛋白酶的失活常数,验证结果表明动力学模型与实验结果非常吻合.通过对酶与底物浓度之比、反应时间的调节可有效控制水解作用的程度,从而为利用米渣酶法制备米蛋白肽的产业化实践提供指导.【总页数】6页(P166-171)【作者】李湘;彭地纬;熊华;赵强;李薇【作者单位】南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学生命科学与食品工程学院,江西,南昌,330047;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学生命科学与食品工程学院,江西,南昌,330047;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学生命科学与食品工程学院,江西,南昌,330047;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学生命科学与食品工程学院,江西,南昌,330047;南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学生命科学与食品工程学院,江西,南昌,330047【正文语种】中文【中图分类】TS201.25【相关文献】1.米渣蛋白酶解及酶解物功能性质研究 [J], 陈升军;熊华;李庭;齐金峰;黄军;彭地纬2.有限酶解米渣蛋白的乳化功能特性表征 [J], 吴姣;郑为完;赵伟学;任东东3.超声促进胰蛋白酶酶解米渣蛋白的研究 [J], 林洮;江漓;赵小虎;高梦祥4.酶解米渣制备大米蛋白的研究 [J], 张群5.超声波协同双酶复合酶解米渣蛋白制备A CE抑制肽工艺研究 [J], XU Min;WU Ai-qun因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

法：
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸 酶等。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进 行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英文缩 写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲 酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化 下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反 应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。
酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0， 25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
的紫外吸收远远构弱于区苯域甲酰，L—与精氨催酸化（英作文缩用写直为B接A）相。 关。
样品胰蛋白酶BAEE活性单位＝

化学生物学论文班级：2009级化学生物学班姓名：学号：胰蛋白酶的研究及应用摘要:以胰蛋白酶为例研究酶的结构与功能。

酶学知识来源于生产与生活实践。

我们祖先很早就会制酱和酿酒。

西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz 从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内（Kuhne）首先把这类物质称为酶（enzyme，其意“在酵母中”）。

1860年法国科学家巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。

1897年，Buchner兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。

1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。

1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶（1946年二人共获诺贝尔化学奖）。

1963年测定第一个牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三维结构（129aa）。

酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。

已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。

美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。

酶所催化的反应称为酶促反应。

在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。

酶所具有的催化能力称为酶活性。

酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。

但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。

一、单纯酶和结合酶单纯酶是仅由肽链构成的酶。

如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。

实验报告酶催化反应的动力学研究一、实验目的本实验旨在通过测定酶催化反应的速率，了解酶对底物的催化效果，并研究酶催化反应的动力学规律。

二、实验原理酶是一种特殊的蛋白质，可以通过降低反应活化能来加速化学反应的进行。

酶催化反应的速率受多个因素影响，包括底物浓度、酶浓度、温度和pH值等。

实验中，我们选择酶催化单糖葡萄糖分解为二糖麦芽糖的反应为示范反应。

该反应可以由麦芽糖酶催化，生成乙酰葡萄糖和葡萄糖。

根据麦芽糖酶催化反应的酶动力学原理，我们可以通过测定不同底物浓度下反应的速率，绘制反应速率与底物浓度的关系曲线，进一步得到酶催化反应的动力学参数。

三、实验步骤1. 准备实验物质：麦芽糖、酵母酶、缓冲液、乙酰葡萄糖标准品。

2. 根据表中的底物浓度计算所需底物量，并分别配制不同浓度的麦芽糖溶液。

3. 取一系列试管，分别加入相应浓度的麦芽糖溶液、酵母酶和缓冲液，混合均匀。

4. 静置一段时间，使反应达到平衡状态。

5. 加入乙酰葡萄糖标准品，继续反应。

6. 每隔固定时间取出一定量的反应液，加入碱液停止反应。

7. 通过比色法测定吸光度，得到各个时间点的吸光度数值。

8. 计算各个底物浓度下的反应速率，并绘制速率与底物浓度的关系曲线。

四、数据处理与分析根据实验所得数据，我们可以得到速率与底物浓度的关系曲线。

一般情况下，酶催化反应的速率与底物浓度呈正相关关系。

随着底物浓度的增加，酶的催化作用增强，反应速率也随之增加。

通过拟合曲线，我们可以得到酶催化反应速率的表达式，进一步计算酶的亲和力和最大反应速率。

酶的亲和力可以通过Michaelis-Menten(Km)常数来表示，最大反应速率可以通过Vmax值来表示。

根据酶动力学的方程式，我们可以计算出底物浓度与酶催化反应速率相关的参数。

这些参数对于进一步研究酶的催化机理和酶抑制剂的研发具有重要意义。

五、实验结果分析根据实验所得数据，我们可以绘制酶催化反应速率与底物浓度的关系曲线。

根据拟合曲线的结果，我们可以得到酶的亲和力(Km)和最大反应速率(Vmax)的数值。

实验一胰蛋白酶的结晶及活力测定原理胰蛋白酶（trypsin，EC.3.4.21.4）通常是以无活性的胰蛋白酶原（trypsinogen）形式存在于动物的胰脏中。

在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌到十二指肠后，在小肠上腔有钙离子的环境中被肠激酶（enterokinase）或胰蛋白酶所激活，其肽链N端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解而失去一个酸性6肽，分子构象发生改变，转变成有生物活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原的M r约为24000，其等电点为pH8.9。

胰蛋白酶的的M r为23400，等电点为pH10.8。

胰蛋白酶在酸性条件下稳定。

通常在pH3.0的溶液内，在4的冰箱内储存数约乃至2年其活性无显著变化。

当溶液的pH值小于2.5时，胰蛋白酶易变性；pH大于5.0时，容易发生自溶；在pH7.6~8.0时，其催化水解的活性最佳。

重金属离子，有机磷化合物和某些反应产物均可抑制胰蛋白酶的活性。

在胰脏、卵清和大豆中含有一些对胰蛋白酶活性具有抑制作用的天然抑制剂。

胰蛋白酶催化水解蛋白质的能力，表现在它对碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度的专一性。

此外，还能催化水解有碱性氨基酸所形成的酰胺键和酯键，胰蛋白酶对这些化学键催化水解活性的敏感性依次是酯键＞酰胺键＞肽键。

因此，可以利用含有这些化学键的人工合成的化合物为底物来研究胰蛋白酶的专一性催化活性。

在动物的胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶的性质相似的蛋白水解酶，即：胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）亦称糜蛋白酶，弹性蛋白酶(elastase)。

在制备过程，采用常规的方法往往很难将三者彼此分离开。

而采用具有高度专一性的亲合层析法可将它们分开。

从胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀析出。

经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀，抽滤后的沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原也被激活。

生物学家研究酶催化反应的动力学酶是一种生物催化剂。

它能够加速化学反应，而不会被反应所消耗。

酶对化学反应的加速作用是由于酶与底物之间的相互作用导致的。

生物学家一直在研究酶催化反应的动力学，以了解酶是如何加速化学反应的。

一、酶的动力学概述酶动力学的研究旨在揭示酶对化学反应的加速机制。

酶的动力学参数包括最大反应速率（Vmax）和底物浓度的一半时酶的反应速率（Km）。

这些参数能够揭示酶对化学反应的速率的影响。

如果我们知道了一个酶的动力学参数，我们就可以预测酶在不同底物浓度下的活性。

二、酶的运动学酶的运动学研究的是酶与底物的相互作用。

该领域的主要目标是了解酶如何与底物结合并进行催化。

酶结合底物的步骤涉及多种方式，包括酶亲和力、底物环境、反应物比例等参数。

研究酶在不同环境下对底物的亲和力和反应速率的响应，能够帮助我们更好的了解酶的催化机制。

三、酶的热力学酶的热力学研究的是酶和底物在不同温度和压力下的相互作用。

酶的活性受温度和压力的影响。

研究酶在不同温度下的酶催化速率，可以帮助我们预测酶在不同生物体系中的催化活性。

压力方面，高压下的酶反应是一种广泛的研究领域，其中包括酶晶体学、生物化学和分子模拟等领域。

四、酶的动力学研究方法酶的动力学研究方法包括酶动力学实验室、计算机模拟、独立组合模型等。

实验室中包括各种光谱技术、动态光散射、色谱分析等实验方法，用于测量酶反应速率，酶活性以及底物结合活性等参数。

计算机模拟则是利用计算机模拟程序在计算机上仿真实验，以便更好的理解酶的催化机理。

独立组合模型是表示酶与底物之间的相互作用的数学模型，也是酶学界中经常使用的一种工具，可以帮助人们更好的理解酶催化机构。

总之，生物学家对酶催化反应的动力学一直保持着高度的兴趣。

酶是生物学界中最重要的催化剂之一，它的研究成果不仅对生物技术研发具有重要影响，同时，对于生物医学、环境保护等领域也有重要的意义。

人类对酶催化反应的深入了解，将有助于我们更好的掌握生命系统的复杂性，为社会的发展带来更多的科技创新。

北京理工大学珠海学院2009届胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究摘要通过沉淀离心法提取胰蛋白酶的专一性抑制剂-鸡卵类粘蛋白（CHOM）,作为亲和配基，利用亲和层析法进行分离纯化胰蛋白酶，接着以抑制剂对酶反应速度的影响了解酶促反应，掌握其规律，来最大限度地实现酶促反应的高效率，寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用，最后SDS-PAGE进行酶纯度检验以及其相对分子量的测定。

关键词：胰蛋白酶鸡卵粘蛋白亲和层析法米氏常数酶促反应动力聚丙烯酰胺凝胶电泳Trypsin of isolation and purification and dynamic researchABSTRACTThrough the precipitation centrifugation extraction specificity of trypsin inhibitor - chicken egg kind mucin (CHOM), as affinity ligands, using the method of affinity chromatography separation and purification, and then to by trypsin inhibitor enzyme reaction speed is known about the effects of enzymatic reaction, grasp their rule, come maximally realize enzymatic reaction efficient, find the most favorable reaction conditions and understand the role in metabolic enzymes, finally sds-page for enzyme and its relative molecular weight inspection purity of determination.目录摘要 (Ⅰ)ABSTRACT (Ⅱ)目录 (Ⅲ)1 引言 (1)2 材料与方法 (1)2.1原料与试剂 (1)2.2仪器设备 (1)2.3实验方法 (2)2.3.1CHOM的分离 (2)2.3.2CHOM的定量 (2)2.3.3胰蛋白酶的分离 (2)2.3.4酶活力的测定 (2)2.3.5纯化效果及纯化蛋白质相对分子量的测定 (2)3 结果与讨论 (3)3.1CHOM的分离和定量 (3)3.2胰蛋白酶的纯化 (4)3.3酶活力的测定 (5)3.4纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定 (6)4总结 (7)参考文献 (8)附录 (9)1 引言胰蛋白酶是取自猪胰脏的一种蛋白质水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族的消化酶。