目的基因的克隆

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。

三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。

四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。

（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。

（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。

2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。

（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。

（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。

3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。

（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。

（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。

2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。

3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。

六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。

第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。

目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。

本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。

一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。

PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。

PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。

2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。

基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。

其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。

基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。

3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。

这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。

限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。

二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。

它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。

分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。

2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。

这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。

化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。

3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。

通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。

同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。

同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。

2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。

3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。

PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。

4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。

5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。

6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。

这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。

7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。

这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。

8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。

9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。

这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。

同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。

一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。

2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。

3. 验证目的基因的克隆是否成功。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。

三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。

2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。

3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。

4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。

5. 连接载体：线性化载体。

6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。

7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。

8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。

四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。

（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。

（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。

2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。

（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。

3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。

（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。

获取目的基因的方法要获取目的基因，首先需要明确目的基因的具体信息，包括基因序列、功能、表达模式等。

然后，可以通过以下几种方法来获取目的基因。

1. 基因克隆。

基因克隆是获取目的基因最常用的方法之一。

通过PCR扩增或文库筛选等技术，可以获得目的基因的DNA序列。

然后，将目的基因插入到适当的载体中，如质粒或病毒载体，从而获得重组DNA。

最后，通过转染、转化等手段将重组DNA导入宿主细胞，实现目的基因的表达。

2. 基因合成。

基因合成是一种人工合成目的基因序列的方法。

通过化学合成的方式，可以按照目的基因的DNA序列，合成相应的DNA片段。

然后，将合成的DNA片段插入到载体中，再转染、转化等手段导入宿主细胞，实现目的基因的表达。

3. 基因突变。

有时候，我们需要获取的是目的基因的突变体。

通过诱发突变、基因编辑等技术，可以得到目的基因的突变体。

然后，将突变体插入到载体中，再转染、转化等手段导入宿主细胞，实现突变目的基因的表达。

4. 基因提取。

有时候，我们需要从已有的生物样品中提取目的基因。

通过DNA提取技术，可以从细胞、组织等样品中提取出目的基因的DNA序列。

然后，将提取的DNA插入到载体中，再转染、转化等手段导入宿主细胞，实现目的基因的表达。

总之，获取目的基因的方法多种多样，可以根据具体需求选择合适的方法。

无论是基因克隆、基因合成、基因突变还是基因提取，都需要严格按照操作步骤进行，并注意实验条件的控制，以确保获取的目的基因是准确、可靠的。

希望本文对您有所帮助，谢谢阅读。

目的基因的获取方法目的基因的获取方法主要有以下几种：1. 合成基因：目的基因可以通过化学合成获得。

合成基因的方法包括了化学合成、PCR扩增等。

化学合成是一种将DNA的碱基顺序按照设计要求合成出来的方法，可以通过商业化的基因合成公司购买所需的目的基因。

PCR扩增是一种通过DNA复制过程扩增目的基因的方法，它需要设计引物来选择性地扩增目的序列。

2. 基因克隆：基因克隆是从已有DNA中提取目的基因的一种常用方法。

通常使用的方法是通过PCR扩增将目的基因获取到，然后将PCR产物接入到适当的载体（如质粒）中，再将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和表达。

这一过程在分子生物学实验室中非常常见，也是目的基因获取的一种可靠途径。

3. 基因合成：基因合成是基于目的基因的序列设计，利用合成生物学技术将目的基因人工合成的过程。

在发展至今，合成生物学技术已经非常成熟，可以通过先进的DNA合成技术和组装技术，按照设计的目的基因序列，将编码目的蛋白质的基因合成起来。

合成生物学技术不仅可以用于合成天然存在的基因，还可以用于合成设计的人工基因。

4. 基因组编辑：基因组编辑技术是一种可以精确修改基因组的技术手段。

通过基因组编辑技术，可以将目的基因进行精确定位的修改或替换。

常用的基因组编辑技术有CRISPR-Cas9系统、TALEN、ZFN等。

这些技术可以通过导入目的核酸序列和编辑工具到细胞中，使细胞内的目的基因发生改变。

总之，目的基因的获取方法可以通过化学合成、PCR扩增、基因克隆、基因合成和基因组编辑等多种手段来实现。

根据不同的需求和实验目的，选择合适的方法可提高实验效率和准确性。

近年来，随着合成生物学和基因组编辑技术的迅猛发展，基因获取已经变得越来越便捷和高效。

●目的基因的克隆1.鸟枪法随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中别离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。

鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆别离。

鸟枪法克隆目的基因的根本战略:A.染色体DNA的切断a)超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。

b)全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。

c)局部酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。

B.与载体连接a)如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，那么选择多拷贝克隆载体；b)如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，那么选择表达型载体。

C.转化受体细胞D.筛选含有目的基因的目的重组子2.cDNA法A.完备别离程序提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于适宜的筛选手段找到目的重组子。

完备别离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。

B.特异别离程序提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳别离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。

特异别离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。

C.差异别离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，别离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于别离克隆新基因。

例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之前方可转录。

任务是要别离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。

双链cDNA的克隆A.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。

B.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段C.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收3.PCR法使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反响所需的双引物。

第九讲目的基因的克隆吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所２０05年8月目录一、基因克隆的一般概念1．基因克隆定义2．“克隆”的不同含义3．基因克隆的过程4．DNA片段的产生与分离5．基因文库二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略2．生物策略3．克隆样品的选择4．基因文库库容测算三、cDＮＡ基因克隆1．概述2．ｃDNA文库的构建3．低丰度mＲNA之cＤＮA克隆4．稀少ｍRNA的ｃDNＡ克隆5．全长ｃDNA的合成6．cDNＡ克隆的优越性四、基因组DNA克隆1．cDNA克隆的局限性2．基因组DNA克隆的优越性3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆1．基因定位克隆概述2．RFＬP分子标记3．RFＬＰ作图原理与步骤4．染色体步移5．大尺度物理图谱的构建ﻬ目的基因的克隆一、基因克隆的概念1．基因克隆的定义基因克隆亦叫做DNＡ克隆(DＮA clonｉｎg)，它是指将外源基因或DNＡ片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子ＤNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DＮA片段的实验操作，叫做基因克隆。

严格地说，基因克隆应叫做ＤＮA克隆,因为被克隆的是基因组的全部（理论上)的ＤＮA片段,而并不是所有的ＤNＡ片段都编码有基因。

＊要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别!完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离!尽管两者之间存在密切的相互关系。

因此在日常交谈中或是一般文字叙述中,甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分,是不妥当的。

*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Moｌecular cloning），实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容,基因克隆的全过程包括如下四个步骤：ａ.DNＡ材料的选择与片段化;ｂ.外源DNA片段与载体分子的连接;ｃ．重组体分子的体外转化；d.转化子克隆的选择或筛选。

２．克隆的不同含义:(动词、名词与形容词)(1)“克隆”的三种含义*1.“克隆”一词作名词时,是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体；*2.“克隆”一词作动词时,则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程；*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用,例如“克隆羊”（cloｎed ｓheep)中的“克隆”便是形容词,这是中文的一个有别于英文的地方。