第6章 目的基因克隆

第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。

目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。

本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。

一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。

PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。

PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。

2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。

基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。

其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。

基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。

3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。

这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。

限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。

二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。

它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。

分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。

2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。

这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。

化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。

3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。

通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。

目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。

这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。

实验：目的基因克隆PCR技术课前预习PCR polymerase chain reaction 反应的基本原理;目的要求1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法;2．认真完成每一步实验操作,详细记录实验现象和结果并加以分析和总结;基本原理类似于DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火复性：模板DNA 经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4 分钟,2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;到达平台期Plateau所需循环次数取决于样品中模板的拷贝;实验用品1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头,硅烷化的PCR 小管,DNA扩增仪PE 公司,琼脂糖凝胶电泳所需设备电泳槽及电泳仪,台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, , ％Triton X-100;②MgCl2 ：25mmol/L;③ 4 种dNTP 混合物:每种L;④Taq DNA聚合酶5U/μl;⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：方法步骤一PCR反应1. 依次混匀下列试剂35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP μl 上游引物引物１μl 下游引物引物２μl 模板DNA约1ng 混匀后离心5秒;2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶μl约,混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上;3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR;最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分;4 电泳按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度; 注意1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行;2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂;3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面;4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照;实验结果注意事项微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化思考题1. 降低退火温度对反应有何影响2. 延长变性时间对反应有何影响3. 循环次数是否越多越好为何4. PCR有哪些用途举例说明;附：PCR知识供参考一PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系：10×扩增缓冲液10ul4 种dNTP 混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA ～2ugTaq DNA聚合酶Mg2+ L加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增;设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右;②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb 的片段;③引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带;ATGC最好随机分布,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败;⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物量：每条引物的浓度～1umol 或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会;酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶;催化一典型的PCR 反应约需酶量指总反应体积为100ul 时,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少;dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性;dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH 或1M Tris;HCl的缓冲液将其PH调节到～,小量分装,-20℃冰冻保存;多次冻融会使dNTP 降解;在PCR 反应中,dNTP 应为50～200umol/L, 尤其是注意 4 种dNTP 的浓度要相等等摩尔配制, 如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低,就会引起错配;浓度过低又会降低PCR 产物的产量;dNTP 能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低;模板靶基因核酸：模板核酸的量与纯化程度,是PCR 成败与否的关键环节之一,传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本;SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别是与DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸;提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应;一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR 扩增;RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止RNase降解RNA;Mg2+浓度：Mg2+对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR 反应中,各种dNTP 浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为～L为宜;Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少;PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数;温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点;在标准反应中采用三温度点法,双链DNA 在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸;对于较短靶基因长度为100～300bp 时可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性;①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因;一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响;此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性,就会导致PCR 失败;②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素;变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合;由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞;退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度;对于20 个核苷酸,G+C 含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想;引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值解链温度=4G+C＋2A+T复性温度=Tm值-5～10℃在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR 反应的特异性;复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合;③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60 核苷酸/S/酶分子55℃24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时, DNA合成几乎不能进行;PCR 反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合;PCR 延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的;3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min;延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现;对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些;循环次数：循环次数决定PCR 扩增程度;PCR 循环次数主要取决于模板DNA的浓度;一般的循环次数选在30～40 次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多;PCR 反应特点特异性强PCR 反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA 特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性;其中引物与模板的正确结合是关键;引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的;聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA 聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合复性可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度;再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高;灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克pg=10 -12 g量级的起始待测模板扩增到微克ug=10 -6 g水平;能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR 的灵敏度可达3 个RFU空斑形成单位；在细菌学中最小检出率为3 个细菌;简便、快速PCR 反应用耐高温的Taq DNA 聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应;扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广;对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板;可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测;PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论;PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法;凝胶电泳分析：PCR产物电泳,EB 溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性;PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件;琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶,供检测用;聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析;酶切分析：根据PCR 产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究;分子杂交：分子杂交是检测PCR 产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法;Southern 印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链内部寡核苷酸标记后做探针,与PCR 产物杂交;此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR 产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研;斑点杂交：将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR 产物特异性鉴定及变异分析;核酸序列分析：是检测PCR 产物特异性的最可靠方法;PCR 常见问题总结PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h 后带型不规则甚致消失;假阴性,不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④PCR循环条件;寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究;模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;⑤模板核酸变性不彻底;在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性;需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭;引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决;如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等;Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带;反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul;或100ul,应用多大体积进行PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败;物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率;有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一;靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR 扩增是不会成功的;假阳性出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高;引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行PCR 扩增时, 扩增出的PCR产物为非目的性的序列;靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性;需重新设计引物;靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性;这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒;所用离心管及样进枪头等均应一次性使用;③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸;二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性;可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除;出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带;非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体;二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR 循环次数过多有关;其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增;其对策有：①必要时重新设计引物;②减低酶量或调换另一来源的酶;③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;④适当提高退火温度或采用二温度点法93℃变性,65℃左右退火与延伸;出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带;其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起;其对策有：①减少酶量,或调换另一来源的酶;②减少dNTP的浓度;③适当降低Mg2+浓度;④增加模板量,减少循环次数;PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生;污染原因一标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染;二PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.三PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题, 因为PCR产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml,远远高于PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR 产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性;还有一种容易忽视,最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染;据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题;四实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见;因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大;污染的监测一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染;对照试验1. 阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志;阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高100 个拷贝以下,但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大;因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照;2. 阴性对照:每次PCR 实验务必做阴性对照;它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR 扩增,以监测试剂是否污染;3. 重复性试验4. 选择不同区域的引物进行PCR 扩增防止污染的方法一合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开;最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区;其实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA;二吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题;由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;三预混和分装PCR试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装,如有可能,PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存;以减少重复加样次数,避免污染机会;另外,PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱;四防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用;五设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照;六减少PCR 循环次数,只要PCR 产物达到检测水平就适可而止;七选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部;开管动作要轻,以防管内液体溅出;参考文献一、主要教学参考书：1.基因工程原理第二版.吴乃虎编著,科学出版社2.分子克隆实验指南第三版.黄培堂等译,科学出版社3.基因克隆和DNA分析.魏群等译,高等教育出版社4.最新分子生物学实验技术梁国栋主编,科学出版5分子生物学实验指导主编：魏群高等教育出版社施普林格出版社二、主要参考文献：, SN, ACY Chang and L Hsu, 1972, Sci. 69:2110., HC and J Doly. 1979.,Nucleic Acids Res. 7:1513., C and P Borst, 1972.,Biochim. Biophys. Acta 269:192.F, RL Rodriguez, PJ Greene, MC Betlach, HL Heyneker, HW Boyer, JH Crosa, and S Falkow, 1977b,,Gene 2:95.K, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn and H Erlich, 1986.,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263.。

实验单元6：基因克隆学号No.：姓名Name：日期Date：2014，04，26摘要：基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。

通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。

本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增β-actin基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。

结果显示：只有少数组别成功克隆出目的基因片段。

关键词：基因克隆；T-A克隆；团头鲂；β-actin基因一、前言对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。

以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过限制性内切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物时，在引物的)!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后，将PCR产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上[1]。

这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则有可能切断PCR产物。

近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4 DNA 聚合酶补平，另一种是T-A克隆法。

其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一。

但是，在采用T-A克隆法时，随着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。

●目的基因的克隆1.鸟枪法随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中别离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。

鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆别离。

鸟枪法克隆目的基因的根本战略:A.染色体DNA的切断a)超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。

b)全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。

c)局部酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。

B.与载体连接a)如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，那么选择多拷贝克隆载体；b)如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，那么选择表达型载体。

C.转化受体细胞D.筛选含有目的基因的目的重组子2.cDNA法A.完备别离程序提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于适宜的筛选手段找到目的重组子。

完备别离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。

B.特异别离程序提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳别离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。

特异别离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。

C.差异别离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，别离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于别离克隆新基因。

例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之前方可转录。

任务是要别离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。

双链cDNA的克隆A.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。

B.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段C.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收3.PCR法使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反响所需的双引物。

目的基因序列克隆的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。

一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。

最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。

将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。

在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。

以下就常用技术的基本原理加以介绍。

一、根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)、G418等。

当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。

如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。

例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。

载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。

例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。

根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。

第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。

2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。

二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。

2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。

4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。

5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。

7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。

8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。

9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。

我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。