目的基因PCR扩增产物的克隆

扩增目的基因实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特定的目的基因，以便后续的基因分析、克隆和表达等研究工作。

二、实验原理PCR 技术是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的方法。

其基本原理基于 DNA 半保留复制的机制，通过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤的循环进行。

在高温下，双链 DNA 模板解链成为单链；在低温下，引物与单链模板结合；在适温下，DNA 聚合酶以引物为起始点，沿着模板链合成新的 DNA 链。

经过多次循环，目的基因得以大量扩增。

三、实验材料与设备1、材料模板 DNA：含有目的基因的基因组 DNA 或 cDNA 片段。

引物：根据目的基因的序列设计的一对特异性寡核苷酸引物。

dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：包括 dATP、dCTP、dGTP 和dTTP。

Taq DNA 聚合酶。

PCR 缓冲液。

无菌去离子水。

2、设备PCR 仪。

微量移液器。

离心管。

电泳仪。

琼脂糖凝胶。

四、实验步骤1、反应体系的配制在无菌的离心管中，依次加入以下成分：模板 DNA：＿____ng上游引物：＿____μM下游引物：＿____μMdNTPs：各_____mMTaq DNA 聚合酶：＿____U10×PCR 缓冲液：＿____μL无菌去离子水补足至总体积_____μL2、 PCR 反应条件设置预变性：95°C 5 分钟变性：95°C 30 秒退火：根据引物的退火温度，一般为 55 65°C 30 秒延伸：72°C 30 秒 1 分钟（根据目的基因的长度而定）循环次数：一般为 30 35 个循环终延伸：72°C 5 10 分钟3、 PCR 产物的检测配制 1 2%的琼脂糖凝胶。

取适量的 PCR 产物与上样缓冲液混合，点样于琼脂糖凝胶的加样孔中。

以适当的电压进行电泳，观察 PCR 产物的条带。

五、实验结果与分析1、电泳结果经过电泳，在凝胶成像系统中观察到了预期大小的条带，表明目的基因成功扩增。

同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。

同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。

2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。

3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。

PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。

4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。

5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。

6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。

这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。

7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。

这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。

8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。

9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。

这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。

同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。

基因克隆的一般程序
基因克隆通常包括以下步骤：
1.选择一个目标基因，并设计引物：在开始之前选择要克隆的
基因，并设计引物。

引物通常包括两个寡核苷酸序列，它们与目标基因的两端相匹配，并且在引物的末端含有限制性内切酶识别位点。

2.将目标基因PCR扩增：使用引物进行PCR扩增，从而扩增
目标基因。

PCR扩增过程中，添加限制性内切酶识别位点的
引物，则可以获得含有限制酶切割位点的PCR产物。

3.剪切PCR产物：将PCR产物用限制性内切酶进行切割，因
为PCR产物含有限制性酶切割位点，因此可以选择正确的限
制性内切酶来切割。

4.连接载体：将PCR产物和质粒（或其他载体）用T4 DNA
连接酶连接在一起。

质粒通常被用作载体，因为它们可以在细胞内稳定复制。

5.转化：将连接好的质粒导入大肠杆菌等推动器中，并将其生
长在培养基上，以让它们自我复制。

6.筛选克隆：使用蓝白斑筛选法确定哪些细菌含有转化的基因。

该方法利用质粒上的LacZ基因，这可以使含有原核素三硝基
甲酸的菌落变成蓝色，而不含此基因的细菌则是白色的。

7.确定序列：将可能的克隆 DNA 提取出来，然后将其进行测序，从而确定克隆基因的精确序列。

8.表达蛋白质：克隆基因的表达，可以用来表达蛋白质。

这可以通过让此基因插入到一个表达载体中来完成，然后将其转化至宿主细胞中，也可对其进行人工表达分析。

一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。

2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。

3. 验证目的基因的克隆是否成功。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。

三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。

2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。

3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。

4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。

5. 连接载体：线性化载体。

6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。

7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。

8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。

四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。

（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。

（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。

2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。

（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。

3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。

（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。

目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。

这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。

同源序列法克隆目的基因-回复同源序列法克隆目的基因，是一种通过引入同源序列来克隆特定目的基因的方法。

在这篇文章中，我们将逐步回答什么是同源序列法克隆目的基因，为什么使用同源序列法克隆目的基因，以及如何利用这种方法来克隆目的基因。

一、什么是同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆目的基因是一种利用已知的同源序列来寻找和克隆特定目的基因的方法。

同源序列指的是在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性的DNA序列。

这些同源序列在进化过程中保留下来，其存在可以起到指导相同或类似基因的功能和表达的作用。

因此，通过利用已知的同源序列，研究人员可以迅速准确地寻找并克隆目的基因。

二、为什么使用同源序列法克隆目的基因1. 提高克隆效率：同源序列法可以利用已知的同源序列来辅助基因寻找和克隆，大大提高了克隆的效率。

相比于传统的克隆方法，同源序列法可以节省大量的时间和实验成本。

2. 降低错误率：由于同源序列在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性，利用同源序列进行克隆可以降低基因寻找的错误率。

同源序列可以帮助确定目的基因的大致位置，并提供设计引物和克隆步骤的依据，从而减少寻找目的基因过程中可能出现的错误。

3. 拓宽研究领域：同源序列法可以跨物种进行基因克隆，使得研究人员可以从其他物种中寻找和克隆目的基因。

这种方法可以为研究人员提供更多资源，丰富研究内容，拓宽研究领域。

三、如何利用同源序列法克隆目的基因1. 寻找同源序列：首先，研究人员需要确定目的基因所在的物种，然后在已知的同源序列数据库中寻找与目的基因相似或相关的同源序列。

常用的数据库包括GenBank、EMBL和DDBJ等。

2. 序列比对和分析：将寻找到的同源序列与目的基因的参考序列进行序列比对和分析，确定相似性和相关性的程度。

根据比对结果，可以选择最相似或相关的同源序列作为目的基因的起始点。

3. 引物设计：根据已选择的同源序列，在目的基因的起始点和末端设计引物，以便进行PCR扩增。

基因的克隆测序步骤以及注意事项一、DNA目的片段的扩增反应体系：cDNA（gDNA）2.0μL10×Buffer 2.0μLMg2+ 1.6μLdNTPs 1.2μL引物F 0.6μL引物R 0.6 μLTaq polymerase 0.3μLddH2O 11.7μLTotal 20μL加适量石蜡油，扩增反应在PTC-220 Tetrad Thermal Cycler (MJ Research)上进行。

PCR反应程序：94℃ 3 min94℃30 s55℃*40 s 33cycles72℃1kb/1 min72℃10 min4℃保存*：PCR退火温度由引物序列（GC含量）决定。

二、琼脂糖凝胶电泳检测（1）1g的琼脂糖倒入装有100mL NEB的三角瓶中。

（一般0.2g琼脂糖加20ml 水可以倒1/4面平板）（2）微波炉加热至澄清无气泡，稍微冷却加1-2滴EB染色液（）（3）将胶倒入装置好的电泳托盘中，冷凝后放入电泳槽。

（4）点样，90V-120V，20min左右。

（5）电泳结束后置于凝胶成像仪下观察拍照。

三、片段的回收（1）在紫外灯下切下含目的DNA的琼脂糖胶块，放入1.5mL的管中。

（2）按每100mg琼脂糖加入300μL DE-A液（溶胶液）的比例加DE-A液，置75℃6~8min，每2min颠倒一次离心管，直至胶块完全溶化（当目的片段小于400bp时，加入1/3 DE-A体积异丙醇。

当目的片段大于400bp时，可省略此步骤）。

（3）加入1/2 DE-A体积的DE-B溶液，混合后转入吸附柱，12000g离心30s，倒去下管中的液体。

（4）在吸附柱中加入500μL W1液（洗涤液），12000g离心30s，倒去下管的液体。

（5）再在吸附柱中加入700μL W2液，静置1min，12 000g离心30s，倒去下管中的液体。

重复一次。

（6）12000g离心1min。

（7）将吸附柱取出放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入20μL TE，静置1min后（或稍长），12000g离心1min。

第1篇一、实验背景聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的方法，广泛应用于分子生物学领域。

目的基因扩增实验是分子生物学实验中的一项基本技能，通过PCR技术可以将微量的目的基因片段扩增到足够数量，便于后续的基因克隆、基因表达、基因测序等研究。

本实验旨在通过PCR技术扩增目的基因片段，并对扩增结果进行鉴定。

二、实验目的1. 掌握PCR技术的基本原理和操作步骤；2. 学会设计引物和优化PCR反应条件；3. 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定。

三、实验材料1. 实验试剂：PCR试剂盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、上下游引物、10×PCR缓冲液等；2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、恒温水浴箱等；3. 实验耗材：无菌离心管、DNA纯化柱、琼脂糖凝胶、电极等。

四、实验方法1. 引物设计：根据目的基因序列，设计特异性引物，确保扩增片段长度适中，避免非特异性扩增。

2. PCR反应体系配置：按照PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液等。

3. PCR反应程序：根据实验目的和引物Tm值，设计合适的PCR反应程序，通常包括预变性、变性、复性、延伸等步骤。

4. PCR反应：将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中，按照预定的PCR反应程序进行扩增。

5. 琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物条带。

6. 结果分析：根据电泳结果，判断目的基因是否成功扩增，并分析扩增产物的大小和纯度。

五、实验结果1. 电泳结果：在琼脂糖凝胶电泳中，观察到目的基因片段的条带，其大小与预期结果相符。

2. 结果分析：根据电泳结果，可以确定目的基因成功扩增，扩增产物大小为预期值。

六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是PCR实验成功的关键因素之一，需要根据目的基因序列设计特异性引物，避免非特异性扩增。

实验：目的基因克隆PCR技术课前预习PCR polymerase chain reaction 反应的基本原理;目的要求1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法;2．认真完成每一步实验操作,详细记录实验现象和结果并加以分析和总结;基本原理类似于DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火复性：模板DNA 经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4 分钟,2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;到达平台期Plateau所需循环次数取决于样品中模板的拷贝;实验用品1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头,硅烷化的PCR 小管,DNA扩增仪PE 公司,琼脂糖凝胶电泳所需设备电泳槽及电泳仪,台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, , ％Triton X-100;②MgCl2 ：25mmol/L;③ 4 种dNTP 混合物:每种L;④Taq DNA聚合酶5U/μl;⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：方法步骤一PCR反应1. 依次混匀下列试剂35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP μl 上游引物引物１μl 下游引物引物２μl 模板DNA约1ng 混匀后离心5秒;2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶μl约,混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上;3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR;最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分;4 电泳按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度; 注意1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行;2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂;3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面;4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照;实验结果注意事项微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化思考题1. 降低退火温度对反应有何影响2. 延长变性时间对反应有何影响3. 循环次数是否越多越好为何4. PCR有哪些用途举例说明;附：PCR知识供参考一PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系：10×扩增缓冲液10ul4 种dNTP 混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA ～2ugTaq DNA聚合酶Mg2+ L加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增;设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右;②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb 的片段;③引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带;ATGC最好随机分布,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败;⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物量：每条引物的浓度～1umol 或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会;酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶;催化一典型的PCR 反应约需酶量指总反应体积为100ul 时,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少;dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性;dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH 或1M Tris;HCl的缓冲液将其PH调节到～,小量分装,-20℃冰冻保存;多次冻融会使dNTP 降解;在PCR 反应中,dNTP 应为50～200umol/L, 尤其是注意 4 种dNTP 的浓度要相等等摩尔配制, 如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低,就会引起错配;浓度过低又会降低PCR 产物的产量;dNTP 能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低;模板靶基因核酸：模板核酸的量与纯化程度,是PCR 成败与否的关键环节之一,传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本;SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别是与DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸;提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应;一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR 扩增;RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止RNase降解RNA;Mg2+浓度：Mg2+对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR 反应中,各种dNTP 浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为～L为宜;Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少;PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数;温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点;在标准反应中采用三温度点法,双链DNA 在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸;对于较短靶基因长度为100～300bp 时可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性;①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因;一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响;此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性,就会导致PCR 失败;②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素;变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合;由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞;退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度;对于20 个核苷酸,G+C 含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想;引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值解链温度=4G+C＋2A+T复性温度=Tm值-5～10℃在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR 反应的特异性;复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合;③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60 核苷酸/S/酶分子55℃24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时, DNA合成几乎不能进行;PCR 反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合;PCR 延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的;3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min;延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现;对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些;循环次数：循环次数决定PCR 扩增程度;PCR 循环次数主要取决于模板DNA的浓度;一般的循环次数选在30～40 次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多;PCR 反应特点特异性强PCR 反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA 特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性;其中引物与模板的正确结合是关键;引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的;聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA 聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合复性可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度;再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高;灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克pg=10 -12 g量级的起始待测模板扩增到微克ug=10 -6 g水平;能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR 的灵敏度可达3 个RFU空斑形成单位；在细菌学中最小检出率为3 个细菌;简便、快速PCR 反应用耐高温的Taq DNA 聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应;扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广;对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板;可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测;PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论;PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法;凝胶电泳分析：PCR产物电泳,EB 溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性;PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件;琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶,供检测用;聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析;酶切分析：根据PCR 产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究;分子杂交：分子杂交是检测PCR 产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法;Southern 印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链内部寡核苷酸标记后做探针,与PCR 产物杂交;此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR 产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研;斑点杂交：将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR 产物特异性鉴定及变异分析;核酸序列分析：是检测PCR 产物特异性的最可靠方法;PCR 常见问题总结PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h 后带型不规则甚致消失;假阴性,不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④PCR循环条件;寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究;模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;⑤模板核酸变性不彻底;在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性;需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭;引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决;如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等;Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带;反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul;或100ul,应用多大体积进行PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败;物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率;有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一;靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR 扩增是不会成功的;假阳性出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高;引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行PCR 扩增时, 扩增出的PCR产物为非目的性的序列;靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性;需重新设计引物;靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性;这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒;所用离心管及样进枪头等均应一次性使用;③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸;二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性;可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除;出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带;非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体;二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR 循环次数过多有关;其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增;其对策有：①必要时重新设计引物;②减低酶量或调换另一来源的酶;③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;④适当提高退火温度或采用二温度点法93℃变性,65℃左右退火与延伸;出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带;其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起;其对策有：①减少酶量,或调换另一来源的酶;②减少dNTP的浓度;③适当降低Mg2+浓度;④增加模板量,减少循环次数;PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生;污染原因一标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染;二PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.三PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题, 因为PCR产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml,远远高于PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR 产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性;还有一种容易忽视,最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染;据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题;四实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见;因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大;污染的监测一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染;对照试验1. 阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志;阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高100 个拷贝以下,但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大;因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照;2. 阴性对照:每次PCR 实验务必做阴性对照;它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR 扩增,以监测试剂是否污染;3. 重复性试验4. 选择不同区域的引物进行PCR 扩增防止污染的方法一合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开;最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区;其实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA;二吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题;由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;三预混和分装PCR试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装,如有可能,PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存;以减少重复加样次数,避免污染机会;另外,PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱;四防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用;五设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照;六减少PCR 循环次数,只要PCR 产物达到检测水平就适可而止;七选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部;开管动作要轻,以防管内液体溅出;参考文献一、主要教学参考书：1.基因工程原理第二版.吴乃虎编著,科学出版社2.分子克隆实验指南第三版.黄培堂等译,科学出版社3.基因克隆和DNA分析.魏群等译,高等教育出版社4.最新分子生物学实验技术梁国栋主编,科学出版5分子生物学实验指导主编：魏群高等教育出版社施普林格出版社二、主要参考文献：, SN, ACY Chang and L Hsu, 1972, Sci. 69:2110., HC and J Doly. 1979.,Nucleic Acids Res. 7:1513., C and P Borst, 1972.,Biochim. Biophys. Acta 269:192.F, RL Rodriguez, PJ Greene, MC Betlach, HL Heyneker, HW Boyer, JH Crosa, and S Falkow, 1977b,,Gene 2:95.K, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn and H Erlich, 1986.,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263.。

如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段基因的构建程序基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
5 ‘
5 5‘
‘ 聚合
5
‘ 5 退火
‘ 5 ‘
5 ‘
变性
5 ‘ 5
‘ 聚合
5 ‘ 5 ‘
5
5‘
底物 ‘
5
‘ 5
引物 ‘
5 ‘
5
加热
‘
5
5
‘
底物 ‘
5 ‘ 5
2. PCR克隆目的基因的基本程序
由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带 有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因 为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基 的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接 ，也可以使用专门的T载体克隆
5’ A
A PCR扩增产物 5’
T7 lacZ MCS ori 5’
T
Apr T T 载体 5’
3. PCR盒式引物扩增法
5‘ 端不含磷酸基 团
变性 引物退火
Sau3A部分酶切 加装盒式接头片段

第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。

本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。

三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。

2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。

四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。

（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。

2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。

（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。

3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。

（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。

4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。

（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。

5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。

（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。

（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。

基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。

下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。

这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。

然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。

2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。

常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。

3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。

4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。

5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。

这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。

6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。

然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。

克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。

7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。

这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。

8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。

这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。

9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。

10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。

这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。

11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。

可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。

12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。

总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。

PCR产物的克隆PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。

平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。

载体可用EcoR V 或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。

如果要求不高，PCR产物也可不加处理。

如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。

平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。

最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。

如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。

另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。

一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。

也可以用末端转移酶来完成加T反应。

载体自连、PCR产物串连可以忽略。

如果使用ddTTP，效果会更好。

这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。

一、PCR产物的TA克隆1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。

其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。

以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。

1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。

引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。

引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。

一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。

2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。

DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。

3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。

这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。

在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。

4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。

PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。

变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。

退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。

延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。

这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。

5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。

每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。

PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。

6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。

凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。

一、实验目的1. 掌握基因克隆的基本原理和操作步骤；2. 学习基因克隆转化实验技术；3. 验证目的基因在受体细胞中的表达。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因从基因组中提取出来，并在受体细胞中稳定复制、表达的过程。

基因克隆转化实验主要包括以下步骤：目的基因的提取、克隆载体构建、目的基因与克隆载体的连接、转化受体细胞、筛选阳性克隆、鉴定阳性克隆等。

三、实验材料1. 材料：大肠杆菌DH5α、克隆载体pUC19、目的基因片段、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、离心机、恒温培养箱等；3. 试剂：LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等。

四、实验方法1. 目的基因的提取：采用PCR技术扩增目的基因片段，利用限制性内切酶将目的基因片段与克隆载体连接；2. 克隆载体构建：将目的基因片段与克隆载体pUC19连接，构建重组克隆载体；3. 转化受体细胞：将重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α中；4. 筛选阳性克隆：在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养转化后的菌落，挑选白色菌落进行PCR验证；5. 鉴定阳性克隆：对PCR验证阳性的菌落进行菌落PCR，将扩增产物进行电泳，观察条带是否与预期大小一致。

五、实验结果1. 目的基因提取：PCR扩增产物电泳结果显示，目的基因片段大小与预期一致；2. 克隆载体构建：重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α后，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，观察到白色菌落；3. 筛选阳性克隆：PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因片段；4. 鉴定阳性克隆：菌落PCR结果显示，阳性克隆中含有与预期大小一致的目的基因片段。

六、实验讨论1. 实验过程中，DNA连接酶和限制性内切酶的用量、转化效率等因素对实验结果有一定影响，需根据实际情况调整；2. 实验中，菌落PCR验证和鉴定阳性克隆是确保实验结果准确的关键步骤；3. 基因克隆转化实验技术在生物科研和生物医药领域具有广泛的应用前景。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上
升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表 DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率， n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实 际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着
三、PCR的成分和作用： 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl （三氨基甲烷）(pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μ g / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫 苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
的目的片段；用于DNA杂交技术中DNA探针的制备；用于环
境生物多态性的分析。 • DNA探针是用生物素、荧光素等物质进行标记的能够与 待测基因进行特异性互补产生杂交信号的DNA片段。荧光 探针、寡聚核苷酸探针等已被应用于监测水中的大肠杆菌， 取得了很好的结果。为了更灵敏、快速的检测水中大肠杆 菌，目前DNA探针技术多于PCR技术结合使用。
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反 应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)：
加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。
94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling): 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结 合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结 构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
PCR的原理3

pcr扩增目的基因实验报告PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增目的基因，可以在短时间内获得大量的目的基因产物。

本文将介绍PCR扩增目的基因的实验过程和结果分析。

一、实验目的本实验的目的是通过PCR扩增目的基因，以便后续的分析和应用。

PCR技术的优势在于其高效、快速和特异性，可以在短时间内获得大量的目的基因产物。

二、实验材料与方法1. 材料：（1）PCR试剂盒：包括聚合酶、引物、dNTPs等。

（2）DNA模板：包括待扩增的目的基因DNA。

（3）PCR仪：用于控制反应温度。

2. 方法：（1）DNA提取：从待扩增的样品中提取目的基因DNA，可以采用常规的DNA 提取方法，如酚/氯仿提取法或商用DNA提取试剂盒。

（2）PCR反应体系的准备：按照PCR试剂盒说明书中的比例将试剂加入PCR 反应管中，同时加入目的基因DNA模板。

（3）PCR扩增：将PCR反应管放入PCR仪中，按照以下程序进行扩增：预热（95℃，5分钟）；循环反应（95℃，30秒；退火温度，30秒；72℃，时间根据目的基因大小确定，一般为1分钟/千碱基）；最终延伸（72℃，10分钟）。

（4）PCR产物分析：将PCR扩增产物进行电泳分析，可以采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

三、实验结果与分析通过PCR扩增目的基因后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳分析。

结果显示，在目的基因区域出现了明显的特异性条带，证明PCR扩增成功。

此外，我们还观察到PCR扩增产物的大小与预期一致，表明PCR反应的特异性良好。

根据PCR扩增产物的大小，我们可以进一步判断目的基因的存在与否。

如果PCR扩增产物与预期大小一致，则说明目的基因存在于样品中；反之，如果未观察到特异性条带，则说明目的基因不存在或浓度过低。

此外，PCR扩增产物的强度也可以反映目的基因的相对丰度。

如果PCR扩增产物的强度较弱，则说明目的基因在样品中的浓度较低；反之，如果PCR扩增产物的强度较强，则说明目的基因在样品中的浓度较高。