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藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
藻蓝蛋白的提取方法1.PBS 缓冲液直接提取法(1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。
(2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。
(3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。
(4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。
2藻蓝蛋白的富集分离2 .1螺旋藻细胞的破碎准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .3 等电点法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 将藻蛋白粗提液pH调节为3 .0 、4 .0 和5 .0 , 即藻蓝蛋白的等电点附近,静置过夜, 于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)充分溶解, 再于-4 ℃高速离心机中以10 000 r/min 离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .4 藻蓝蛋白的收率和分离因数分别计算藻蓝蛋白的收率(Y )、浓缩率(m)和分离因数(β):式(3)-(5)中, N(g/L)为藻液比, 0 和t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液.双水相萃取（1）藻蓝蛋白的初步提取。
藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用蓝绿藻是一种广泛存在于水体中的微生物，具有丰富的蛋白质，其中具有生物活性的藻蓝蛋白是其重要成分之一。
藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理功能，在食品领域中的应用也越来越受到人们的关注。
首先，提取藻蛋白是藻蓝蛋白分离纯化的第一步。
一种常用的方法是溶解蓝藻细胞膜，并通过离心等操作将藻蛋白从细胞中分离出来。
然后，可以使用尺寸排除色谱、离子交换色谱和亲和色谱等技术进一步纯化。
这些分离纯化的方法能够去除其他蛋白质和杂质，提高藻蓝蛋白的纯度。
藻蓝蛋白在食品中的应用有许多潜力。
首先，在抗氧化方面，藻蓝蛋白具有很高的自由基清除能力，可以减少食品在贮存和加工过程中的氧化反应，延长食品的保鲜期。
另外，藻蓝蛋白还能够稳定食品中的颜色，使颜色更加鲜艳。
这一特性使得藻蓝蛋白可以广泛应用于饮料、糕点等食品中，提高产品的市场竞争力。
其次，藻蓝蛋白还具有抗炎和抗肿瘤的作用。
研究发现，藻蓝蛋白能够抑制炎症反应中的炎症介质释放，从而减轻炎症反应对人体的伤害。
在食品加工过程中，添加藻蓝蛋白可以减少食品中的致炎物质的生成，提高食品的健康性。
此外，藻蓝蛋白还具有一定的抗肿瘤活性，可以用于开发新型的抗肿瘤功能性食品。
除此之外，藻蓝蛋白在食品领域中的应用还包括改善食品的营养价值和口感。
藻蓝蛋白中富含的氨基酸和多种微量元素可以提高食品的营养价值。
同时，藻蓝蛋白还具有一定的凝胶特性，在食品中可以改善质地和口感，提高食品的口感感受。
然而，尽管藻蓝蛋白在食品中的应用潜力巨大，但也面临一些挑战。
首先，藻蓝蛋白的生产成本较高，加上其稳定性和保存性能较差，限制了其在食品中的广泛应用。
其次，藻蓝蛋白作为一种新型成分，还需要进一步研究其对人体健康的影响，以确保其在食品中的安全性。
综上所述，藻蓝蛋白具有广泛的蛋白质来源、多种生理功能及一定的应用潜力，在食品领域中的研究和开发也取得了一些进展。
随着科学技术的不断发展，相信藻蓝蛋白在食品中的应用将会得到更大的推广和应用。
一、实验目的本实验旨在通过学习并掌握藻蛋白的提取方法，了解不同提取方法对藻蛋白提取效果的影响，并对提取得到的藻蛋白进行初步的纯化及鉴定。
二、实验原理藻蛋白主要存在于藻类植物中，如螺旋藻、小球藻等。
藻蛋白的提取方法主要有物理法、化学法和生物法。
本实验采用物理法中的冻融法提取藻蛋白，该方法操作简单，对藻类植物损伤小，提取效率较高。
三、实验材料与仪器材料：1. 螺旋藻粉2. 蒸馏水3. 0.1mol/L的KOH溶液4. 0.1mol/L的HCl溶液5. 95%乙醇6. 无水乙醇7. 丙酮8. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）仪器：1. 电子天平2. 磁力搅拌器3. 超声波清洗器4. 高速离心机5. 蒸发皿6. 烧杯7. 离心管8. 吸管9. 滤纸四、实验步骤1. 藻蛋白粗提1. 称取10g螺旋藻粉，置于100ml离心管中。
2. 加入50ml蒸馏水，充分搅拌，使螺旋藻粉充分溶解。
3. 将混合液置于冰浴中冷却，每隔30分钟搅拌一次，共冷却2小时。
4. 冷却完成后，以4000r/min的转速离心10分钟，收集上清液。
5. 将上清液转移至烧杯中，加入95%乙醇，使蛋白质沉淀，静置30分钟。
6. 以4000r/min的转速离心10分钟，收集沉淀。
7. 将沉淀用蒸馏水洗涤三次，以去除杂质。
2. 藻蛋白纯化1. 将洗涤后的沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。
2. 将混合液通过DEAE纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。
3. 收集含有藻蛋白的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后得到藻蛋白。
五、实验结果与分析1. 藻蛋白粗提通过冻融法提取的藻蛋白，在95%乙醇中沉淀，经离心后得到淡蓝色沉淀，表明藻蛋白提取成功。
2. 藻蛋白纯化通过DEAE纤维素层析柱纯化后，得到的藻蛋白在紫外-可见光谱上呈现出典型的藻蓝蛋白特征峰，表明纯化成功。
六、实验结论本实验采用冻融法和DEAE纤维素层析柱法成功提取并纯化了藻蛋白。
实验结果表明，冻融法是一种简单、高效的藻蛋白提取方法，而DEAE纤维素层析柱法可以进一步纯化藻蛋白，提高其纯度。
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在进行藻蓝蛋白的生产之前，藻种培养是关键的第一步。
藻蛋白的分离纯化及光谱性质研究Isolation, purification of phycobiliprotein from Porphyra and itsspectroscopic properties一、实验目的和要求1. 了解藻蛋白的生理意义和功能，藻蛋白一般的纯化方法；2. 掌握盐析和凝胶层析的实验技术；3. 掌握紫外可见光谱仪检测蛋白的方法；4. 了解藻蛋白的荧光发射特性。
二、实验原理藻蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，参与光合作用的能量吸收和传递，主要存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体中。
藻蛋白主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三类。
藻蛋白在藻类中的含量可达细胞干重的25%～28%, 除了作为荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究之外，藻胆蛋白具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要药理功能，在功能食品、化妆品和药品中有广泛的应用前景。
我国藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，是获取藻蛋白的理想资源。
选用紫菜提取藻红蛋白，具有成本低、得率高的优点，具有较好的利用价值。
1．蛋白质的盐析沉淀盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
2．葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
单个凝胶珠本身象“筛子”。
不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
藻蓝蛋白含量测定的方法1.方法原理：样品用磷酸盐缓冲液溶解，置冰箱中冷冻、融解，使色素蛋白析出，分离后的提取液用分光光度法测定。
2.试剂：磷酸缓冲液：将0.1M磷酸二氢钾溶液与0.1M磷酸氢二钾溶液混合（45+55，V/V）。
溶液的PH=7.03.仪器设备分光光度计、超声波振荡仪、离心机：3000r/min、低温水箱:-20℃、50ml离心管4.样品测定称取样品0.25g～0.5g(精确到0.001g)，用缓冲液溶解，超声振荡5min，定容于250ml容量瓶中，摇匀。
将全部溶液转入250ml广口塑料瓶中，至于-20℃冰箱内冷冻12h（或放置过夜），取出解冻、摇匀。
取部分溶液于离心管中，在3000r/min的转速下离心15min，取上清液于比色皿中。
在分光光度计上分别测定620nm、652nm、562nm处的吸光度（缓冲溶液作空白）。
5.结果计算X1=0.187A620-0.087A652X2=0.196A652-0.041A620X3=0.104A562-0.021 X1-0.088 X2X1―测试液中藻蓝素的含量（mg/mL）X2―测试液中异藻蓝素的含量（mg/mL）X3―测试液中藻红素的含量（mg/mL）X4―试样中藻蓝蛋白的质量分数（g/100g）A―相应波长处测得的吸光值V―样品定容体积m―试样质量注意：1.测定结果取平行实验结果的算数平均值，保留到小数点后两位。
2.平行实验允许误差（相对）不大于4%。
3.整个操作过程中须注意避光，分光光度测定应在15min内完成。
藻蓝蛋白浓度的测定采用紫外-可见吸收光谱法测定藻蓝蛋白的浓度,螺旋藻中藻蓝蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准,藻蓝蛋白在620Fnm处有最大吸收值,其含量测定参Bennett 的研究进行计算式中:Cpc为样品溶液中藻蓝蛋白的浓度,mg/mL;A620为样品溶液在波长620nm下的吸光值;A652为样品溶液在波长652Fnm下的吸光值。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度作者：邱李莉来源：藻蓝蛋白提取纯化测定专题资源时间：2007-11-18一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度的方法二、实验材料螺旋藻藻粉三、实验设备天平，量筒，塑料杯，药匙，小烧杯（5个），铁架台，铁夹，玻棒（若干），胶头滴管（若干），滤纸，收集器，树脂柱，梯度洗脱器，蠕动，磁力搅拌器，高速离心机四、实验原理1.冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。
如此重复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2.盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶)，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
（生物秀实验频道——专心专注！ ）3.DEAE－纤维素：英文名称DEAE－Cellulose，二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g 功能基：二乙基胺乙基.弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换。
性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
4.葡萄聚糖凝胶：商品名称Sephadex，是效果较好的分子筛凝胶层析。
原理：分子筛指多孔介质。
小分子能进入介质内部空隙，大分子物质排阻在介质之外，从而达到分离目的，这种作用为“分子筛效应”。
5.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装法是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随机将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶液慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降至需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
6.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(体积越小越有利于提高分辨率)。
7.洗脱：待样品液的液面流到固体相表面时，用滴管加入洗脱剂(5cm)，并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。
洗脱流速：如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全，如果太慢，洗脱物会扩散。
8.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液样品的浓度或活性为纵坐标)。
五、实验步骤1.取螺旋藻粉颗粒20粒，每颗0.5g,一共取藻粉0.5g/粒×20=10g，倒入塑料瓶中，加提取液100ml。
2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。
实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液67.8ml，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
4.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末8.72g，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到20％。
在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得亮蓝色上清液67.2ml，弃去蓝色沉淀。
5.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末12.7g，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50％。
在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得深蓝色沉淀，弃去黄绿色上清液。
加不超过15ml蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。
6.剪取约25cm长的层析袋，放入烧杯中煮沸5min（从水沸开始计时），将其中一头用细线扎住，对折后再用细线扎住。
将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。
放入蒸馏水中，4℃下透析2—3天。
7.取一支层析柱，检漏后清洗干净，用两个铁夹固定在铁架台上，要从正面和侧面检查是否竖直，如不竖直则作出调整。
称取40gDEAE—纤维素—52于一烧杯，加150ml0.5MHCL 溶液，轻搅,浸20min，小心倒掉上清液，补水到同一刻度，轻轻搅拌溶液，均匀地倒入柱中。
柱中液面上要保留2～3cm的空间，之后液面每下移到原刻度位置，就补水到相应高度，使蒸馏水始终高于填料2cm以上。
8.以下由老师完成。
用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。
接着用0.5MHCL溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。
后用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。
最后用0.02M，pH6.5磷酸缓冲液平衡过夜。
至此，层析柱准备完毕。
9.剪一片刚好可以覆盖填料平面的滤纸，轻放入填料面。
将准备好的层析柱中的缓冲液放出，待液面比填料高出大约只有1cm时，关闭柱开关。
用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。
待液面离柱口只有大约2cm距离时，把开关完全打开，一边继续滴加粗提液。
现象：开始有颜色分层，由上到下分别为蓝色，绿色，黄色10.待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，滴加50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗残余粗提液，不要一次加入，应先加少量把残余粗提液冲洗干净(至溶液澄清为止)，再大量加入。
最后加入0.5MNaCL—0.02M，Ph6.5磷酸缓冲液（流速：1.0ml/min）。
第一次洗脱后现象：洗脱一段时间后出现红色层，最后出现明显的四个分层，由上到下分别为蓝色，绿色，青色，粉红色。
11.小心观测，待有浅蓝色溶液流出时，马上开始收集，5ml一管（共收集了14管）。
由于气温较高，边收集边将收集好的溶液倒入试管，用滤纸封口，排好顺序,贴上标签4℃保存待测。
收集到试管后，试管内溶液的颜色变化：浅→深→浅12.取出冷冻保存的试管，以磷酸缓冲溶液为空白对照管,用分光光度计测其OD620nm,。
实验结果见表1。
13.根据A620nm可知，蛋白含量最高为第4管，取该管溶液稀释后用紫外可见光谱仪作200nm～700nm扫描,测藻蓝蛋白纯度。
实验结果见表2及附件。
3.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
至于影响的大小，取决于各组的操作。
3)装柱：装柱的好坏直接影响到实验结果，将DEAE－纤维素溶液倒入层析柱后，并保持水面高于柱面1～2cm，若液面水不足，则可能使柱间出现断层，影响下一步的过柱。
4)过柱：用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。
待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，用少量的0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗管壁，待填料上面的溶液澄清，无明显蓝色时，再分次加入50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲。
由各管光吸收值曲线图可看出，我们接样时间较晚，第一管光吸收值已达1.290，应该再蓝色离柱底1cm左右时开始接样，而我们是等到差不多见到样液显蓝色时才接样，所以曲线不是两边对称的。
在测各管光吸收值时，由连续5管在2.590左右，而我们只是拿最高即第四管，光吸收值为2.600那管测其藻蓝蛋白纯度，也许在其他管中，藻蓝蛋白纯度较高，因为这几管的光吸收值偏差很小。
七、实验总结及分析1．螺旋藻是一种多细胞丝状蓝藻，螺旋藻是蓝藻门颤藻科的单细胞藻类，内含一种特殊的色素蛋白——藻蓝蛋白，约占藻体干重的10％——24.8％。
据报道，藻蓝蛋白可提高人体免疫机能、增强造血功能，可用作肿瘤、贫血等疾病的辅助治疗药剂；螺旋藻蓝蛋白的水溶液呈泽蓝色。
藻胆蛋白主要有藻蓝蛋白（简称CPC）、藻红蛋白、异藻蓝蛋白（简称APC）和藻红蓝蛋白四大类。
螺旋藻中是以CPC和APC为主。
从藻蓝蛋白三维结构而言，是由a —和p—亚基构成，每个亚单位有1——2个被称为“藻胆素”发色基组成。
螺旋藻为蓝藻的一个属，含有多种营养成分，具有营养及医疗保健功能，它被世界粮农组织（FAO）誉为21世纪人类最理想、最完美的食品。
螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种。
它由18种氨基酸组成，氨基酸组成合理并含有人体所必需的8种氨基酸。
但是，目前，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于受其溶解性质的局限性，使其应用受到一定的限制螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻,因含有多种对人体有益的营养物质而受到广泛的关注,其突出特点是氨基酸种类齐全且蛋白质含量高,其中含量最高的藻蓝蛋白(PC)和别藻蓝蛋白(APC)一直是基础研究的热点,因为它们不仅在光合作用的原初反应机理的探索方面有重要意义,而且可以作为生物体内的荧光示踪物质,作为天然的色素蛋白也具有十分广阔的应用前景。
