吲哚乙酸氧化酶活性测定

吲哚乙酸氧化酶活性的测定一、原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。

植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。

酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。

吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

二、仪器及药品T6新悦型分光光度计离心机恒温水浴锅天平研钵试管移液管烧杯20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）。

1mmol/L2，4—二氯酚：称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml。

1mmol/L氯化锰：称取MnCl2·4H2O 19.8mg用蒸馏水配制成100ml。

1mmol/L吲哚乙酸：称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml)，稀释至刻度。

吲哚乙酸试剂A或B（任备其中之一）：试剂A：15ml 0.5mol/L FeCl3，300ml浓硫酸（比重为1.84），500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。

用时1ml样品中加入试剂4ml。

试剂B：10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。

用时于样品中加入试剂。

试剂B较试剂A灵敏。

三、操作步骤1．将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3梍4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。

2．取0.5g下胚轴，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，置冰浴中研磨成匀浆。

再按100mg鲜重材料加0.5ml磷酸缓冲液的比例，用磷酸缓冲液洗涤研钵。

离心（4000r/min）10分钟，所得上清液即为粗酶液。

3．取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。

另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。

一起置于30℃恒温水浴中，保温30分钟。

处理MnCl22、4-二氯酚IAA(175ug/mL)酶液磷酸缓冲液(pH6.0)实验组对照组1111221564．吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂B 4ml，摇匀，置于30℃的黑暗处保温30分钟，使显色。

吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC4105规格：100T/48S产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。

临用前加入5mL蒸馏水备用。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

临用前加入3mL蒸馏水备用。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。

临用前加入5.71mL50%乙醇（乙醇（V）：HO（V）=1：1）溶解备用。

2可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。

临用前加入15mL试剂四溶解。

O（V）标准品：粉剂×1支，-20℃保存，10mg吲哚乙酸。

临用前加入1.14mL50%乙醇（乙醇（V）：H2=1：1）溶解制成50μmol/mL的标准溶液。

可分装后-20℃保存。

产品说明：吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。

IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平，从而影响植物的生长。

作用生成红色产物，在530nm下有最大吸收峰。

酶活力的大小可用破坏IAA IAA在无机酸条件下与FeCl3的速率表示。

自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

测定操作：1、样本处理：第1页，共3页（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

12000g4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。

（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。

12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

2、操作步骤：（1）可见分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至530nm。

实验一植物组织渗透势的测定（质壁分离法）一、实验目的植物细胞的渗透势主要取决于溶液的溶质浓度，因此又称溶质势。

渗透势与植物水分代谢、生长及抗性密切相关。

在干旱、盐渍等条件下，一些植物常在细胞内主动积累溶质，以降低其渗透势，增加吸水能力，在一定程度上保持膨压，保持细胞的生长和气孔的开放，这种现象称为渗透调节作用。

渗透调节能力的大小可以用逆境条件下细胞的渗透势的降低值来表示，在水分生理与抗性生理研究中经常需要测定。

掌握质壁分离法测定植物细胞渗透势的原理和方法。

二、实验原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势，该溶液的浓度称为等渗浓度。

当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度。

带入公式即可计算出其渗透势。

三、实验材料、仪器设备和试剂1. 实验材料洋葱鳞茎（最好是紫色洋葱）2. 仪器设备光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、干净的小培养皿、滴瓶、吸水纸。

3. 试剂（1）1 mol/L蔗糖溶液，（2）蔗糖系列标准液以1 mol/L蔗糖溶液作为母液，配置梯度溶液: 0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.5、0.55、0.60、0.65、0.70 mol/L的蔗糖溶液。

四、实验步骤1. 取10套干燥洁净的小培养皿，编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。

2. 用刀片在洋葱鳞片外表皮或其它带有色素的组织表皮上纵横划成0.5cm2左右的小块，用镊子将表皮小块轻轻撕下，依次迅速投入各浓度蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，并立即盖好皿盖。

浸泡10～15分钟。

3. 从0.70 mol/L 蔗糖溶液开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上载玻片，于显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的表皮做制片，进行同样观察，并记录质壁分离的相对程度。

一、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚比色法测定）酶液的制取称取0.5g鲜重叶片，加入1ml磷酸缓冲液（PH=7.8,0.05mol/L），冰浴研磨，研磨后再加入4ml磷酸缓冲液。

将研磨液倒入离心管中，平衡。

12000r/min、0-4℃下离心20min，上清液即为酶提取液。

离心后冷藏保存。

POD: 取上清液20微升加入比色杯中（对照加20微升磷酸），加3ml反应液，马上读470nm 下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0，1，2min的OD值）。

反应液：PH＝6.0的磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28微升，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H2O219微升混合保存于冰箱中。

POD活性=ΔA470*V/（a*W）V-酶液总体积（ml）；a-测定时酶液体积（ml）；W-样品重（g）可溶性蛋白含量的测定取上清夜20微升（对照加20微升水），加3ml考马斯亮蓝，放置2min后，马上于595mn 下比色。

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C*V/a）/(W*1000)C-查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V-提取液总体积（ml）；a-测定所取提取液体积（ml）；W-取样量（g）。

可溶性蛋白含量（ug）：y=0.0061x－0.0359（R2=0.9563）二、多酚氧化酶（PPO）活性测定（比色法测定）PPO活性的测定参照李焕秀（1994）的方法进行改进。

一、原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。

多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如邻苯二酚（儿茶酚）和多巴。

二、材料：树皮韧皮部（分别在压条育苗前期、愈伤组织形成期、根原基形成期和不定根生长期进行取样）三、仪器与用具：高速低温台式离心机；分光光度计；1mL 、5mL的移液管；5mL离心管；研钵；试管数支；10mL容量瓶；秒表；水浴锅；四、试剂：1、0.1mol·L-1，pH 6.0的磷酸柠檬酸缓冲液；2、1%（10g/L）的邻苯二酚（1g用蒸馏水定容至100 mL）；3、0.1%(1/L)的脯氨酸（0.1g（0.05）用蒸馏水定容至100 mL（50））；4、石英砂；五、方法步骤1、酶液提取取鲜样0. 5－1.0g, 加1 mL 磷酸柠檬酸缓冲液（0.1mol·L-1，pH 6.0），加少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆,加缓冲液9mL稀释（按100mg鲜重材料加1mL提取液的比例），使终体积为10mL（研完冰盘放回冰箱）。

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断植物（Plant）吲哚乙酸（IAA）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被吲哚乙酸（IAA）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的吲哚乙酸（IAA）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法1.样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。

2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3.植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。

4.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

上海笃玛生物科技有限公司试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48pmol/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。

测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。

然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。

在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。

以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。

PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。

混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。

PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。

黄瓜体内吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性变化曹明兰;王永;云兴福【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2005(020)F12【摘要】用4000mg／L，5000mg／L，6000mg／L，7000mg／L，8000mg ／L和9000mg／L浓度的乙烯利在黄瓜种子期进行雌性化处理（浸泡），以蒸馏水为对照，研究了黄瓜叶片内吲哚乙酸氧化酶活性变化。

结果表明，子叶期各处理酶活性均极显著低于对照，各处理分别比对照低了16．989％、16．487％、14．52％、21．685％、30．828％和28．674％，与对照有极显著差异：第一真叶至第三真叶期得处理吲哚乙酸氧化酶活性仍低于对照，与对照行极显著差异；在子叶期至第三叶期，经过8000mg／L处理后的黄瓜叶片内吲哚乙酸氧化酶活性显著低于其他各处理，与其他各处理有极显著差异。

【总页数】3页(P33-35)【作者】曹明兰;王永;云兴福【作者单位】内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特010019;内蒙古农牧业科学院,内蒙古呼和浩特010019【正文语种】中文【中图分类】S642.201【相关文献】1.黄瓜体内吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性变化 [J], 曹明兰;王永;云兴福2.光叶楮扦插生根的吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、过氧化物酶活性变化研究 [J], 宋丽红;曹帮华3.吲哚乙酸处理桉树插条后氧化酶活性及同工酶变化与生根关系的比较研究 [J], 李明;黄卓烈;谭绍满;林韶湘;龙腾;林海球4.桉树等植物吲哚乙酸氧化酶活性变化与插条生根的比较研究 [J], 黄卓烈;林韶湘5.采后‘伏’苹果吲哚乙酸氧化酶和过氧化物酶活性的变化 [J], 关军锋;于凤鸣;李海瑞;马建军;李兴明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

吲哚乙酸氧化酶活性的测定一实验原理吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平，从而影响植物的生长。

生长素分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛的部位。

IAA氧化酶是一种含Fe的血红蛋白，以二价锰离子和一元酚为辅因子。

降解产物包括CO2和3-亚甲基羟吲哚等。

酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即：IAA氧化酶活力= IAA减少的速率。

在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。

该物质在530nm处有最大光吸收峰。

二实验材料与试剂1、材料：玉米幼苗的胚根、胚芽。

2、试剂：20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)；1mmol/L的2、4-二氯酚；1mmol/L的氯化锰；200ug/mL 的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）；试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)，(使用前混合，避光保存）。

三实验步骤1、提取IAA氧化酶：称取0.3g玉米幼苗的胚根、胚芽，加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.0）1.5mL，冰浴研磨，4000rpm离心10分钟，取上清液，即为粗酶液。

2、IAA氧化酶与IAA的反应：两管分别混匀，25 ℃水浴保温30min。

3、IAA氧化酶活性测定混合试剂B：0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50)30min后另取2支试管，每支加入试剂B 4mL，再按表加入反应液或对照溶液各2mL 。

2支试管于40 ℃下保温30min，使反应液呈红色。

530nm处测OD值，分别记为OD实验、OD对照。

4、制作标准曲线：同时，配制IAA梯度浓度溶液各10mL另取7支试管，每支加入试剂B 2mL，再按表加入IAA的梯度浓度溶液各1mL 。

以0管溶液调零，分别测定530nm处吸光值。

5、结果计算：以0~6管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据实验、对照管的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA浓度。

IAA氧化酶活性（ugIAA/g FW.h) =(C对照-C实验)*V T*V/W.t.V1VT：酶液总体积（即上清液体积）；V：步骤2所得反应液体积（即5ml）；V1：反应所用酶液体积（即1ml）。